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《北方農業學報》2016年第4期

摘要：

試驗對1株苜蓿根瘤菌M2進行了培養條件及發酵配方的優化。通過設置不同的溫度、pH值、轉速，并調整發酵配方，得到最適發酵工藝：最適溫度為30℃，最適pH值為滅菌前7.5，最適轉速為180r/min。經進一步調整配方后，菌數可穩定在90×108cfu/mL。

關鍵詞：

苜蓿；根瘤菌；條件優化；配方

根瘤菌是一類革蘭陰性菌，這類菌廣泛的分布于土壤中并能與豆科植物共生，通過侵染豆科植物根部形成根瘤，固定空氣中的分子氮，可為植物提供充足的氮素營養[1]，還可降低因施用化肥引起的環境污染。土壤中氮素70%來自生物固氮，而根瘤菌與豆科植物的共生固氮體系所固定的氮量就占到了約總量的65%[2-3]。草產業在國民經濟和農牧業發展中起基礎性作用[4]，紫花苜蓿是豆科植物，因具有廣泛的適應性和優良的生態效應，品質優良且產量高，在我國的農牧業中占有重要地位[5-6]。苜蓿根瘤菌這一共生固氮體系的穩定高效是栽培苜蓿獲得高產的關鍵因素[7]。隨著現代生物技術的發展，科學家對苜蓿根瘤菌的研究越來越深入，從單純的固氮領域延伸至生理、生化、生態領域，同時也對固氮菌劑、菌肥的開發利用進行了大量探索[8-9]。本研究對豆科植物根瘤菌的發酵工藝進行優化，不僅能夠降低生產成本、提高產量，還可減少工業氮肥施用量，減輕環境污染[10]，具有重要的經濟、生態效益。

1材料和方法

1.1菌種

本研究所用菌種M2為本實驗室自行篩選鑒定得到，液體菌種20%甘油-20℃保存。

1.2常用儀器

電熱恒溫培養箱（韶關市泰宏醫療器械有限公司，LRH-150B）、超凈工作臺（蘇凈集團蘇州安泰空氣技術有限公司，SW-CJ-2F）、電熱旋轉式恒溫搖床（江蘇太倉市實驗設備廠，THZ-D）、渦旋振蕩器（澳門市其林貝爾儀器制造有限公司）。

1.3試劑

蔗糖、酵母粉、豆餅粉、甘露醇、氯化鈉、KH2PO4、K2HPO4、MgSO4•7H2O、CaCO3、NaOH、HCl、pH試紙。

1.4基礎培養基配方

YMA培養基：甘露醇10g/L，酵母粉0.8g/L，氯化鈉0.1g/L，KH2PO40.25g/L，K2HPO40.25g/L，MgSO4•7H2O0.2g/L，CaCO33.5g/L。

1.5最適溫度的選擇

設置溫度梯度26，28，30，32，34℃。甘油保存的液體菌種于冰盒中融化，取500μL菌液加入到50mLYMA液體培養基（滅菌前pH值7.0）中，180r/min恒溫搖床振蕩培養36h后，鏡檢無雜菌即進行稀釋涂布計數。

1.6最適pH值的選擇

設置YMA培養基滅菌前pH值梯度6.5，7.0，7.5，8.0，8.5。甘油保存的液體菌種于冰盒中融化，取500μL菌液加入到50mLYMA液體培養基中，180r/min，30℃恒溫搖床振蕩培養36h后，鏡檢無雜菌即進行稀釋涂布計數。

1.7最佳轉速的選擇

設置搖床轉速梯度140，160，180，200，220r/min。甘油保存的液體菌種于冰盒中融化，取500μL菌液加入到50mLYMA液體培養基（滅菌前pH值7.5）中，30℃恒溫搖床振蕩培養36h后，鏡檢無雜菌即進行稀釋涂布計數。

1.8優化培養基

用蔗糖代替YMA培養基中成本較高的甘露醇，添加豆餅粉作氮源，設置蔗糖和豆餅粉的不同用量及比例，設6組處理。分別是：（1）蔗糖10g/L+豆餅粉2g/L；（2）蔗糖10g/L+豆餅粉4g/L；（3）蔗糖16g/L+豆餅粉2g/L；（4）蔗糖16g/L+豆餅粉4g/L；（5）蔗糖20g/L+豆餅粉2g/L；（6）蔗糖20g/L+豆餅粉4g/L。在最適溫度、pH值及最適轉速條件下培養36h后計數。

2結果與分析

2.1菌株在不同培養溫度條件下生長情況

將在不同溫度條件下培養的M2菌株發酵液培養36h后取樣鏡檢，稀釋涂布計數，結果如圖1。從圖1中可以看出，該菌的最適培養溫度為30℃，在此溫度條件下菌數最多。

2.2菌株在不同pH值條件下生長情況

將不同pH值條件培養的M2菌株發酵液培養36h后取樣鏡檢，無雜菌稀釋涂布計數，結果如圖2。從圖2中可以看出，該菌在滅菌前培養基pH值7.5的條件下生長狀況最佳。酸或堿性條件下的菌數均受到影響。

2.3菌株在不同培養轉速條件下生長情況

前面確定最適pH值和溫度后，設定不同轉速梯度進行試驗，培養36h后取樣進行稀釋涂布計數，結果如圖3所示。從圖3可以看出，設定轉速180r/min時，菌生長情況最佳。2.4配方優化結果對6組配方培養的發酵液進行計數結果統計，結果如圖4所示。從圖4中可以看出，優化后的配方均提高了發酵液菌數，其中以處理（5）（蔗糖20g/L+豆餅粉2g/L）的配方菌數最高，可穩定在90×108cfu/mL。

3結論與討論

本研究通過對苜蓿根瘤菌M2進行溫度、pH值、轉速的選擇及發酵配方的優化，得出了該菌培養的最適溫度為30℃，培養基滅菌前的最佳pH值為7.5，發酵轉速最佳設定為180r/min，在YMA培養基基礎上進行優化后，最適的培養配方為：蔗糖20g/L，豆餅粉2g/L，酵母粉0.8g/L，氯化鈉0.1g/L，KH2PO40.25g/L，K2HPO40.25g/L，MgSO4•7H2O0.2g/L，CaCO33.5g/L。在該條件和配方下，M2的液體發酵的菌數可以穩定在90×108cfu/mL。相對于甘露醇來說，蔗糖和豆餅粉的成本較低，取材和來源廣泛，利用蔗糖和豆餅粉極大地提高了產量，降低了生產成本，為大規模工業生產提供了基礎。

參考文獻：

［1］沈世華，荊玉祥.中國生物固氮研究現狀和展望［J］.科學通報，2003，48（6）：532-540.

［2］陳丹明，曾昭海，隋新華，等.紫花苜蓿高效共生根瘤菌的篩選［J］.草業科學，2002，19（6）：27-31.

［4］馬興祥，劉明春，尹東.祁連山草原氣候和草地資源開發利用［J］.草原與草坪，2000（3）：37-39.

［5］周敏.中國苜蓿栽培史初探［J］.草原與草坪，2004（1）：44-46.

［7］史曉霞，師尚禮，楊晶，等.豆科植物根瘤菌分類研究進展［J］.草原與草坪，2006（1）：12-17.

［8］師尚禮.苜蓿根瘤菌固氮研究進展及淺評［J］.中國草地學報，2005，27（5）：63-68.

［9］師尚禮.紫花苜蓿根瘤菌研究進展［J］.甘肅農業大學學報，2005，40（2）：262-267.

［10］寧國贊，李元芳，劉惠琴，等.我國豆科牧草根瘤菌選育及應用研究的進展（1981～1988年）［J］.中國草地學報，1989（3）：68-73.

作者:閆洪雪 劉露 李麗 趙宏濤 張鵬鵬 梁文輝 單位:青島明月海藻集團有限公司 青島明月藍海生物科技有限公司