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《畜牧與獸醫雜志》2014年第六期

1材料與方法

1.1測定指標與測定方法

1.1.1常規營養成分分析按AOAC方法測定試驗樣品中干物質(DM)、有機物(OM)、粗蛋白(CP)、粗脂肪(EE)和粗灰分(h)含量，采用VanSoest等方法測定中性洗滌纖維(NDF)及酸性洗滌纖維(ADF)。

1.1.2發酵指標測定發酵過程中測定動態產氣量以及甲烷產量，于24、48、72及96h時分別結束發酵并測定發酵液pH值、VFA、NH3－N及MCP濃度。產氣量測定參照Theodorou等方法;甲烷產量測定參照胡偉蓮等氣相色譜法;終點時冰浴終止發酵，立即測定pH;參照秦為琳氣相色譜方法測定VFA;NH3－N濃度測定參照Weathburn方法;考馬斯亮藍比色法測定MCP濃度;發酵液(50mL離心管)于10000r/min離心機離心5min，棄上清液，將沉淀轉移到相應標記的坩堝中，在105℃烘箱中烘12h后稱重，并灰化，計算DMD、OMD。之后采用VanSoest等方法，配制中性洗滌劑和酸性洗滌劑分別測定發酵前后苜蓿的NDF、ADF，計算NDFD、ADFD。

1.2數據分析試驗數據經Excel2007初步整理后用SPSS(17.0)進行One－WayANOVA分析，用Duncan''''s法進行多重比較。試驗結果以平均值±標準誤(Mean±SEM)表示，相關性分析采用雙變量相關中的雙側檢驗，當P＜0.05時認為差異顯著。

2結果

2.1苜蓿體外發酵累計產氣量和甲烷產量變化隨發酵時間延長，苜蓿累計產氣量以及甲烷產量呈逐漸上升趨勢，前24h發酵較為迅速，36h以后基本趨于穩定。不同物候期刈割苜蓿累計產氣量差異顯著(P＜0.05)，現蕾期顯著高于初花期(P＜0.05)，盛花期與初花期差異不顯著(P＞0.05)，發酵96h現蕾期、初花期和盛花期苜蓿累計產氣量分別為196.53、184.88和188.23mL。不同物候期刈割苜蓿體外發酵甲烷產量與產氣量趨勢一致，現蕾期刈割苜蓿甲烷產量顯著高于初花期(P＜0.05)，盛花期與初花期差異不顯著(P＞0.05)，發酵96h現蕾期、初花期和盛花期刈割苜蓿累計甲烷產量分別為39.84、38.61和38.66mL。甲烷產量占總產氣量的比例為19.91～21.47%。

2.2苜蓿體外厭氧發酵DMD、OMD、NDFD和ADFD變化苜蓿體外發酵DMD、OMD、NDFD和ADFD變化見圖1。各處理組DMD、OMD、NDFD和ADFD均隨發酵時間延長逐漸升高，這與苜蓿累計產氣量變化趨勢基本一致，發酵產氣速率越快，苜蓿降解率越高。除96hOMD、NDFD和ADFD差異不顯著(P＞0.05)外，其他各時間點DMD、OMD、NDFD和ADFD均差異顯著(P＜0.05)，現蕾期最高，其次為初花期，盛花期最低。其中DMD為54.27～75.33%，OMD為56.06～74.99%，NDFD為18.47～52.97%，ADFD為21.41～48.17%。

2.3苜蓿體外發酵pH值變化苜蓿體外發酵pH值變化見圖2，各地區、各茬次苜蓿發酵液pH值隨發酵時間增加不斷降低，各組發酵液pH介于6.38～6.58之間。發酵前48h不同物候期苜蓿pH值差異不顯著(P＞0.05)，其他各時間點差異顯著(P＜0.05)，盛花期顯著高于現蕾期(P＜0.05)，初花期與盛花期差異不顯著(P＞0.05)。

2.4苜蓿體外發酵VFA變化苜蓿體外發酵過程中VFA變化情況見表3。隨發酵時間延長，不同物候期刈割苜蓿VFA濃度逐漸升高。不同物候期對苜蓿發酵液24h乙酸濃度、48h丙酸濃度和96h乙酸、丙酸、總揮發酸濃度影響顯著(P＜0.05)。其中乙酸、丙酸和總揮發酸濃度現蕾期最高，丁酸濃度現蕾期最低，初花期與盛花期差異不顯著(P＞0.05)。

2.5苜蓿體外發酵氨態氮和菌體蛋白濃度變化苜蓿體外發酵NH3－N及MCP濃度變化見圖3。隨發酵時間的延長，初花期和盛花期苜蓿NH3－N濃度呈現先升高后降低變化趨勢，72h達到最高;現蕾期和初花期苜蓿MCP濃度先升高后降低，48h達到最高;現蕾期苜蓿NH3－N濃度和盛花期苜蓿MCP濃度隨發酵時間延長不斷升高。各組發酵液的NH3－N濃度介于12.06～21.21mg/dL之間，MCP濃度介于0.17～0.29mg/mL之間。不同物候期的24h、96hNH3－N濃度和24h、48hMCP濃度差異顯著(P＜0.05)，現蕾期NH3－N和MCP濃度顯著高于盛花期(P＜0.05)。其他時間點NH3－N和MCP濃度差異不顯著(P＞0.05)。2.6苜蓿體外發酵各指標之間的相關關系發酵96h時，DMD與OMD、NDFD、ADFD和NH3－N呈顯著正相關(r=0.908，r=0.920，r=0.797，r=0.811，P＜0.05)，與pH呈顯著負相關(r=－0.722，P＜0.05);GP與MP、VFA和NH3－N呈顯著正相關(r=0.814，r=0.726，r=0.618，P＜0.05);NH3－N與OMD、NDFD、GP、MP和MCP均呈顯著正相關(r=0.746，r=0.630，r=0.618，r=0.583，r=0.596，P＜0.05)。

3討論

3.1不同物候期紫花苜蓿的營養價值由表1可知，紫花苜蓿從現蕾期到盛花期營養成分含量有所變化，其中粗蛋白質和粗灰分含量呈逐漸降低趨勢，而NDF和ADF呈逐漸升高趨勢。隨著苜蓿生育期的推移，植株根上部分莖葉比逐漸增加，加之莖葉逐漸老化，細胞壁成分逐漸增加，結構性碳水化合物以及木質素含量增加，而細胞內容物逐漸減少，粗蛋白以及粗灰分含量相應減少。苜蓿在生長過程中粗蛋白質的絕對含量是不會減少的，但是由于生育期的延遲，蛋白質的沉積速度逐漸減慢，而其他碳水化合物等沉積增加，結果是蛋白質所占比例不斷下降，粗纖維的比例增加。本研究中，現蕾期苜蓿粗蛋白含量最高，初花期次之，盛花期最低，由此可見苜蓿從現蕾期到盛花期的營養品質有所下降;而NDF和ADF均隨著生育期的推遲含量升高，但差異均不顯著，這可能是由于三個刈割時期間隔時間較短，苜蓿的營養物質含量變化均不顯著。

3.2不同物候期對紫花苜蓿體外發酵產氣量、甲烷產量和底物降解率的影響飼料中的可溶性碳水化合物為快速降解部分，在發酵初期的產氣速率較快;而富含纖維的底物為不可溶性碳水化合物，為慢速降解部分，發酵初期產氣速率較慢。現蕾期的粗蛋白含量較初花期和盛花期高，而NDF和ADF較初花期和盛花期低，這是引起現蕾期苜蓿累計產氣量曲線上升的原因，也導致了現蕾期苜蓿累計產氣量顯著高于初花期和盛花期。艾麗霞等研究表明，粗纖維含量較低、粗蛋白和無氮浸出物含量較高的底物體外發酵產氣量較高，湯少勛等認為產氣量以及產氣速率也與NDF、ADF呈顯著負相關，張桂杰等研究也發現，豆科牧草理論最大產氣量與NDF和ADF含量呈負相關，而與CP含量呈正相關。本試驗結果顯示，CP含量較高，粗纖維含量較低的現蕾期苜蓿體外發酵累計產氣量顯著高于初花期和盛花期苜蓿，與前人研究結果相似。富含纖維物質的飼料能促進甲烷生成菌以及部分纖維分解菌的共生，微生物利用碳水化合物降解產生的H2還原CO2合成CH4。瘤胃發酵甲烷產量與飼料在瘤胃內的降解率呈正相關，本試驗中現蕾期苜蓿的累計甲烷產量顯著高于初花期和盛花期，側面反映了現蕾期苜蓿在瘤胃中的高降解率。劉樹軍等研究指出，飼草發酵CH4產量與NDF、ADF含量呈顯著正相關，而與CP含量呈顯著負相關。本研究與其結果相反，可能是由于現蕾期苜蓿的可發酵纖維含量較高，導致甲烷生成升高，最終導致產氣量的增加。產氣量能夠準確反應底物降解率，產氣量與DMD和OMD之間存在正相關關系，而苜蓿的營養價值和消化率隨苜蓿生育期的推移而顯著下降，本試驗研究結果顯示，現蕾期底物降解率最高，初花期次之，盛花期最低，這是由于隨著生育期的推移，結構性碳水化合物比例增加，粗蛋白、粗脂肪以及粗灰分等非結構性碳水化合物比例相應減少，導致了消化率下降。

3.3不同物候期對紫花苜蓿體外發酵pH和VFA的影響VFA是反芻動物維持和生產的主要能源物質，主要由瘤胃微生物利用碳水化合物生成，VFA總量的提高表明飼料消化率的上升。發酵96h時，現蕾期苜蓿的乙酸、丙酸以及總VFA均顯著高于初花期和盛花期，表明現蕾期苜蓿營養價值高于初花期和盛花期，由于現蕾期苜蓿的NDF和ADF均低于初花期和盛花期，即易發酵碳水化合物含量較高，導致發酵產生更多的VFA。VFA中乙酸所占比例最大，Schneider等研究表明富含纖維的飼料更趨向于乙酸型發酵，但不影響總VFA含量。由于本試驗設計無瘤胃液外排，發酵導致的揮發酸積累造成了pH的下降，但是由于瘤胃液本身具有一定的緩沖能力，pH在正常范圍內不影響瘤胃微生物的生理活動。

3.4不同物候期對紫花苜蓿體外發酵NH3－N和MCP的影響瘤胃微生物利用飼料中的蛋白質降解成以NH3－N形式存在的N供微生物合成MCP，一定程度上，NH3－N濃度反映了蛋白降解與合成之間的平衡狀況。發酵96h時現蕾期NH3－N濃度顯著高于盛花期，這是由于現蕾期苜蓿的粗蛋白含量要高于盛花期，而且研究還發現，在反芻動物的瘤胃發酵中，保持能氮在速度和數量上的同步性釋放，能夠提高MCP的合成，苜蓿作為反芻動物利用的優質粗飼料，其粗纖維含量較低，粗蛋白質含量較高，在瘤胃發酵過程中，能夠迅速發酵為微生物合成菌體蛋白提供所需能量，使能氮的同步性釋放最大化，也大大提高了MCP的合成效率。

3.5不同物候期紫花苜蓿體外發酵的動態變化及相關性分析瘤胃微生物在降解可消化養分的同時，伴隨著產氣量、甲烷產量的增加、底物降解率的上升及VFA濃度的升高，由于發酵產生的VFA不能被及時消耗而累積造成pH持續下降。張永根等報道指出，豆科牧草有機物降解率與蛋白質降解率呈顯著相關，本研究相關性分析結果顯示，不同刈割時期苜蓿96h累計產氣量與其對應的底物降解率呈正相關，與VFA濃度呈顯著正相關，pH與體外發酵各指標呈負相關，而NH3－N濃度與體外發酵各指標呈正相關。飼料蛋白質中的易降解組分在培養初期能夠迅速發酵，所以在發酵前48hNH3－N和MCP濃度均有所升高;隨著發酵時間延長，由于VFA等產物積累引起pH下降，以及較高的NH3－N濃度可能會影響微生物合成MCP的效率，因此發酵48～72h，NH3－N濃度上升而MCP濃度下降;發酵72～96h，初花期和盛花期苜蓿發酵液中NH3－N濃度有所下降，而MCP濃度有所上升，表明微生物對蛋白質降解以及MCP合成具有一定的調節能力;由于現蕾期苜蓿粗蛋白含量最高，可能是導致發酵液中NH3－N濃度持續上升的原因。

4結論

隨著發酵時間的延長，不同物候期刈割的苜蓿的累計產氣量、甲烷產量、底物降解率及VFA濃度均呈現逐漸升高趨勢，pH呈現逐漸降低趨勢，初花期和盛花期苜蓿NH3－N濃度以及現蕾期和初花期苜蓿MCP產量呈先升高后降低趨勢，而現蕾期苜蓿NH3－N濃度和盛花期苜蓿MCP產量呈逐漸升高趨勢。不同物候期刈割對苜蓿累計產氣量、甲烷產量、底物降解率、NH3－N濃度和MCP產量有顯著影響。現蕾期刈割苜蓿累計產氣量、甲烷產量以及VFA濃度顯著高于初花期(P＜0.05)，其苜蓿底物降解率、NH3－N濃度和MCP產量顯著高于盛花期(P＜0.05)，初花期刈割苜蓿的底物降解率顯著高于盛花期(P＜0.05)，其余體外發酵參數初花期和盛花期差異不顯著(P＞0.05)。綜合分析營養指標及體外發酵參數表明，現蕾期刈割苜蓿營養價值最高。

作者：馬艷艷成艷芬朱偉云單位：南京農業大學動物科技學院消化道微生物研究室