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《廣東微量元素科學雜志》2016年第11期

摘要:

MTT是一種檢測細胞存活和生長的方法。該技術現已廣泛用于生物和醫學等領域。基于此，針對該法進行探討，以期與同行探討，更好地推動生物醫學的發展。

關鍵詞:

MTT法;細胞;檢測

MTT是一種粉末狀化學試劑，化學名為3－(4，5－二甲基噻唑－2)－2，5－二苯基四氮唑溴鹽，商品名為噻唑藍。是一種黃顏色的染料。其用途主要有兩方面，包括藥物(也包括其他處理方式如放射線照射)對體外培養細胞毒性的測定以及細胞增殖和細胞活性測定。該法在生物、醫藥等研究中具有重要作用［1－2］，鑒于此，以下針對該法進行深入探討。

1檢測原理

活性細胞線粒體中的琥珀酸脫氫酶能使外源性MTT還原為水不溶性的藍紫色結晶甲瓚并沉積在細胞中，而死亡細胞則無此功能。二甲基亞砜能溶解細胞中的甲瓚，使用酶標儀在490nm波長處測定其光吸收值，在一定細胞數范圍內，MTT結晶形成的數量值與細胞數成正比。根據測得的吸光度值，來判斷活性細胞數量，吸光度值越大，表明細胞活性越強。若是測藥物毒性，則表示藥物毒性越小。2藥品和儀器MTT配成的終質量濃度為5mg/mL，須用PBS或生理鹽水做溶劑。在配制和保存的過程中，容器應采用鋁箔紙包住，確保其無菌。MTT甲瓚溶解液，二甲基亞砜和三聯溶解液。酶標儀、分光光度計、倒置顯微鏡。

2實驗方法

2.1細胞計數

使用胰酶消化對數期細胞，終止后離心收集，制成細胞懸液，細胞計數后調整其濃度。細胞密度在長到80%至90%，消化離心收集后，將上清液去掉，加入3mL培養基并混勻。取另一支新的15mL無菌離心管，裝入培養基。從第一步準備的3mL細胞懸液中取出1mL，加入上管混勻后進行細胞計數，該濃度相當于細胞計數板4個大格內，其中每大格平均5～10個細胞;如果該濃度不夠，應再根據計數的結果滴加細胞懸液，每滴按50μL計算。細胞數量因實驗目的不同應做相應調整，如一般細胞增殖實驗每孔2000個，細胞毒性實驗每孔5000～10000個。此外，還應根據細胞本身特性，如生長快慢等因素來決定細胞數量。

2.296孔平底板鋪細胞

制備好細胞懸液后，輕輕混勻，每孔加入100μL，確保待測細胞的密度為5000～10000/孔，用無菌PBS填充邊緣孔。因為細胞在混勻后仍要繼續沉降，所以接種的過程中要反復多次混勻，例如每加6個孔時就應混勻一次，用以確保各孔間接種的細胞密度完全相同，進而保證MTT結果的準確性。

2.3藥物處理

在培養箱中培養已接種好的細胞培養板，在孔板底部鋪滿單層細胞時(96孔平底板)，加入不同濃度梯度的藥物。細胞貼壁后即可加藥，時間為2h即可。

2.4觀察

藥效于培養箱中5%CO2，37℃孵育16～48h后，在倒置顯微鏡下觀察藥物的作用效果。

2.5MTT反應

在每孔中加入10μLMTT溶液(5mg/mL，即0.5%MTT)，繼續培養4h。如果藥物與MTT能夠反應，可在離心后棄去培養液，之后小心用PBS沖2至3遍后，再加入含MTT的培養液。

2.6溶解結晶

終止培養，準備溶解結晶。溶解結晶的方法有兩種，一種方法是使用二甲基亞砜溶解。在MTT加入培養4h后，可充分形成結晶。去掉上清液，注意不能把藍紫色結晶甲瓚移走。每孔中加入150μL二甲基亞砜，置搖床上低速振蕩10min，使結晶物充分溶解。在酶聯免疫檢測儀490nm波長處檢測各孔的吸光值。另一種方法是使用三聯溶解液，在MTT加入培養4h后，可充分形成結晶。直接在每孔中加入100μL溶解液。因為該溶解液含有SDS，在低溫保存時易產生結晶，所以在使用之前必須提前幾小時置于室溫中，待SDS結晶全部溶解后方可使用。放入培養箱中繼續孵育4～6h，于鏡下觀察，待結晶全部溶解后于570nm波長處測定其吸光度值。

2.7吸光度測定

應同時設置調零孔(培養基、MTT、二甲基亞砜)，對照孔(細胞、相同濃度的藥物溶解介質、培養液、MTT、二甲基亞砜)，測定各孔吸光度值。

3結果統計方法

采用改良寇式法計算IC50。

4總結

檢測細胞生長、存活和增值的方法有很多種，如BrdU標記法、結晶紫法、酸性磷酸酶法等。每種方法各有其優缺點，而本研究針對MTT檢測細胞存活和生長的方法進行了深入探討。正確掌握該法并將其應用于醫藥研究和生物醫學研究中［3－4］，可以更好地進行科學研究工作，為生物和醫學等領域的發展提供可靠的基礎數據。

作者:張哲 單位:牡丹江醫學院醫藥研究中心