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《廣東畜牧獸醫(yī)科技雜志》2014年第三期

1缺失P基因的狂犬病病毒（def-P）的特性

利用缺失全長P基因的HEP-Flury病毒株的cDNA，通過反向遺傳技術構(gòu)建缺失P基因的狂犬病病毒def-P。使用與缺陷基因有互補功能的細胞系如BHK-P細胞、NA-P細胞拯救病毒，使缺陷病毒增殖和擴增。在將P蛋白作為組成性表達的細胞系中，Def-P病毒能夠通過感染該細胞系復制自身基因組和產(chǎn)生子代病毒，但是相對于親本病毒其生長速率稍有減慢。相反地，def-P病毒感染不表達P蛋白的細胞則不產(chǎn)生子代病毒。試驗發(fā)現(xiàn)在沒有新的P蛋白合成的感染細胞中，def-P病毒可以進行初級RNA轉(zhuǎn)錄，但在次級RNA轉(zhuǎn)錄和病毒基因組RNA復制時則需要新合成的P蛋白。另外，試驗還發(fā)現(xiàn)def-P對細胞具有中等毒性，這可能與其減緩生長的現(xiàn)象有關。

2狂犬病病毒P蛋白抑制干擾素信號轉(zhuǎn)錄途徑

狂犬病病毒能夠在產(chǎn)生干擾素的細胞中復制，表明其本身具有某些機制拮抗干擾素的產(chǎn)生。將狂犬病病毒的P蛋白移至啟動子的遠端或刪除后，P蛋白的表達量減少或缺失，狂犬病病毒失去拮抗干擾素產(chǎn)生的能力；P蛋白部分缺失的試驗表明，只有編碼完整的P蛋白才能抑制β-干擾素的表達。酵母雙雜交篩選法證明，STAT1是狂犬病病毒P蛋白的細胞配偶體。P蛋白C末端與STAT1包括DNA結(jié)合域及卷曲域的區(qū)域相互作用，P蛋白在細胞的表達抑制了α-干擾素和γ干擾素誘導的轉(zhuǎn)錄應答。P蛋白通過滯留細胞質(zhì)中活化的STATs，抑制感染細胞中α/β-干擾素和γ-干擾素刺激的JAK-STAT信號。干擾素刺激應答因子和γ激活序列控制基因的表達，在狂犬病病毒SADL16感染的細胞或共轉(zhuǎn)染質(zhì)粒表達P蛋白的細胞中被嚴重破壞。相比之下，表達少量P蛋白的重組狂犬病病毒失去抑制JAK-STAT信號的能力。STAT1和STAT2的酪氨酸磷酸化作用在表達狂犬病病毒P蛋白的細胞中沒有被損壞，而是與P蛋白一起沉淀。STAT1局限化與P蛋白局限化有關：在核內(nèi)表達P蛋白的細胞中，STAT1存在于細胞核內(nèi)，而在胞質(zhì)表達P蛋白的細胞中，STAT1也存在于細胞質(zhì)內(nèi)。該試驗證實P蛋白能阻礙STAT1在細胞核內(nèi)結(jié)合干擾素應答基因啟動子的階段。這便表明STAT1在細胞質(zhì)的滯留不是參與干擾素抑制的惟一機制。狂犬病病毒P蛋白可通過阻礙干擾素調(diào)節(jié)因子3（IRF-3）的磷酸化，拮抗α/β-干擾素。將P基因移至啟動子下游構(gòu)建的狂犬病病毒SAD△PLP，可引起S386位的磷酸化、二聚化和IRF-3的轉(zhuǎn)錄活性。由轉(zhuǎn)染質(zhì)粒表達的TBK1的IRF-3的磷酸化在野毒型狂犬病病毒感染的細胞或共轉(zhuǎn)染P蛋白質(zhì)粒細胞中被消除。說明P蛋白激活IRF-3的上游激酶是必須的，能有效抑制干擾素應答。

3P蛋白與細胞質(zhì)動力蛋白輕鏈（LC8）的相互作用

P蛋白是一個多功能性的蛋白。用P基因（CVS株）與神經(jīng)生長因子誘導的PC12細胞（鼠腎上腺嗜鉻神經(jīng)瘤細胞）cDNA文庫進行酵母雙雜交試驗，探究P蛋白與細胞胞漿內(nèi)的動力蛋白輕鏈LC8（dyneinlightchain）的相互作用。結(jié)果表明，能在病毒粒子中檢測到LC8；P蛋白缺失分析表明LC8與138-172位之間的氨基酸殘基相結(jié)合，表明LC8與狂犬病病毒在軸突中的運輸有關。在另外一組獨立試驗中，用狂犬病病毒基因I型（PV株）和基因III型（Mokolavirus）的P基因與人腦cDNA文庫進行酵母雙雜交試驗也觀察到P蛋白與LC8相互作用。P蛋白144-149位序列（（N/S）KXTQT）高度保守，可能是與LC8結(jié)合的位點。將與LC8結(jié)合的P蛋白保守序列缺失后的重組病毒與親本病毒對乳鼠的致病性試驗，表明LC8不是狂犬病病毒從外周進入中樞神經(jīng)系統(tǒng)所必須的。LC8曾被認為是連接病毒核蛋白到宿主細胞運輸系統(tǒng)的分子因素，最近的結(jié)構(gòu)研究對該模型提出質(zhì)疑。構(gòu)建攜帶和刪除LC8結(jié)合域（LC8-BD）的重組狂犬病病毒，試驗表明LC8的刪除并沒有抑制其侵入中樞神經(jīng)系統(tǒng)，但可顯著減弱病毒在中樞神經(jīng)系統(tǒng)的轉(zhuǎn)錄和復制。在RAG2基因敲除小鼠中，證實刪除LC8結(jié)合域的重組病毒致弱，說明LC8結(jié)合域使初級轉(zhuǎn)錄減弱，但不會影響狂犬病病毒逆軸突運輸過程，而是通過在神經(jīng)中削弱早期轉(zhuǎn)錄和復制以損傷病毒粒子的感染性。

4Def-P病毒的致病性和免疫原性

HEP-Flury毒株是狂犬病病毒中一種最致弱的毒株，可對乳鼠致死，而成鼠即便是顱內(nèi)接種也不致死。除了表達P蛋白的細胞，def-P病毒對敏感細胞感染率與親本HEP-Flury毒株相同，在其他細胞上則沒有顯著的感染。一組試驗證明，成鼠接種HEP病毒后體重有波動，而接種def-P則沒有；乳鼠以2×103FFU顱內(nèi)接種rHEP引起100%死亡，相反，即使以2×104顱內(nèi)接種def-P病毒并不引起乳鼠死亡和任何臨床癥狀。def-P病毒在乳鼠顱內(nèi)接種后完全不致病的這種特性，是因為def-P能在表達P蛋白的細胞中復制，而在正常的不表達P蛋白的細胞中不能有效復制。用def-P病毒免疫小鼠后可誘導高水平的病毒中和抗體（VNA），而且對所接種小鼠能提供攻毒后的保護力。def-P誘導強大的保護性免疫抵抗狂犬病病毒，幾乎不產(chǎn)生子代病毒和嚴重的宿主損傷。

5近年我國狂犬病病毒P基因的分子遺傳特征

通過對兩株不同疫苗株和兩株分離自寧夏的野毒分析，P基因核苷酸和氨基酸序列相似性分別為83.6%～99.8%和87.2%～99%，P蛋白與胞漿動力蛋白輕鏈LC8相互作用的序列位于143～148位氨基酸殘基，均為DKSTQT，4株病毒P基因作用位點序列顯示未發(fā)生影響其生物學功能的變異。而對4株湖南狂犬病病毒P基因與I型狂犬病病毒和疫苗株核苷酸相似性比較,P基因分別為78.4%～90.2%和81.8%～86.8%；核苷酸序列及推導的氨基酸序列表明湖南株與我國現(xiàn)用的人用及獸用疫苗株存在一定差異。進化關系表明，4株病毒均為基因I型狂犬病毒；與我國寧夏分離株最近；與其它I型毒株分離自菲律賓和泰國等東南亞地區(qū)的毒株親緣關系較近；而與翼手目的毒株關系最遠。

6小結(jié)

分子生物學和反向遺傳學技術的發(fā)展，使人們對狂犬病病毒的研究越來越深入。對病毒分子結(jié)構(gòu)、復制周期、致病性和免疫原性方面的研究，為全面認識狂犬病病毒的結(jié)構(gòu)和功能的關系提供理論基礎和試驗支持。對狂犬病病毒P基因的研究，揭示其在整個病毒粒子中的功能和病毒與宿主之間發(fā)揮的作用。通過反向遺傳學技術構(gòu)建的def-P病毒，為將來可研制出高效、安全、廉價且使用方便的狂犬病減毒活疫苗提供了候選疫苗株。

作者：鄭韶結(jié)施赫赫單位：佛岡縣高崗鎮(zhèn)農(nóng)業(yè)技術綜合服務站廣東省醫(yī)學實驗動物中心