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《農業資源與環境學報》2015年第三期

1材料與方法

1.1土壤樣品土壤采自我國西北地區某市的農田表層土壤，選取具有代表性的5個采樣點，均采取0～20cm的樣品，混合均勻后帶回實驗室。在潔凈實驗室內展開、風干，挑揀其中的植物、殘根、石塊及其他雜物。用木碾研磨過18目篩子。處理后的土樣裝入密封袋中密封保存，備用。土壤樣品的主要理化性質見表1。

1.2實驗設計選取轉化酶、脲酶、堿性磷酸酶活性為指標，Cu、Zn、Pb和培養時間作為因素。實驗因素和水平設計列于表2。外源污染物Cu、Zn、Pb復合作用對3種水解酶活性的影響選用5因素4水平的L16(45)型正交表(實驗1)，在對各因素主效應分析之后，選取Cu、Zn、Pb三因素重新排定L8(27)正交表，用以考察三種污染物之間的交互作用對酶活性的影響(實驗2)。指標水平參照土壤環境質量標準(GB15618-1995)，Cu、Zn、Pb分別以CuSO4•5H2O、Zn(CH3COO)2•3H2O和Pb(CH3COO)2•3H2O溶液形式加入，充分攪勻，加水使土壤濕度保持在土壤最大持水量的60%，置于培養箱內25℃黑暗恒溫恒濕培養，每個處理做3份平行。

1.3測定方法土壤pH值：酸度計法；土壤有機質：重鉻酸鉀法；陽離子交換量：氯化鋇法；重金屬：電熱板濕法消解-ICP-AES法；轉化酶活性測定：3,5-二硝基水楊酸比色法，大小用24h，1g干土生成的葡萄糖毫克數表示；脲酶活性測定：苯酚鈉—次氯酸鈉比色法，大小以24h，1g干土的氨氮毫克數表示；堿性磷酸酶活性測定：磷酸苯二鈉比色法，大小以24h，1g干土生成的酚毫克數表示（以上酶活性測定時均設3份平行，以及用水代替基質的對照樣品和無土對照樣品，以排除土壤和試劑中雜質的干擾）。數據使用Excel2010和Spss18.0進行分析。

2結果與分析

2.1Cu、Zn、Pb復合作用對土壤水解酶活性的影響通過觀察法獲得的平均值（表3）可知，轉化酶活性、脲酶活性及堿性磷酸酶活性的最大值分別出現在實驗3、實驗1和實驗1。對不同因素而言，分析每個水平上三種水解酶的平均值，轉化酶活性、脲酶活性及堿性磷酸酶活性的最大值分別出現A1B1C4D3，A1B2C3D1及A1B1C1D3，并且A1B1C1D3與觀察法的結果一致。方差分析結果顯示（表4），在95%置信區間下，Cu對三種水解酶活性有顯著影響，Zn和Pb對三種水解酶活性影響不顯著。Cu對三種水解酶活性影響程度脲酶＞堿性磷酸酶＞轉化酶。

2.2Cu、Zn、Pb的交互作用及各自主效應對土壤酶活性的影響表5是觀察法的分析結果，轉化酶、脲酶和堿性磷酸酶活性的最大值分別出現在實驗6、實驗4和實驗1。分析每個水平水解酶活性總和的平均值，轉化酶、脲酶和堿性磷酸酶活性的最高值是A2B2C2，A1B2C2及A1B1C2。A1B2C2與觀察法結果一致，其他兩個值與觀察法結果相近。方差分析結果顯示（表6），這些因素與轉化酶活性關系不顯著；Cu和Zn對脲酶活性有顯著影響(p＜0.05)，Cu×Zn在p＜0.10時對脲酶活性有顯著影響；其他因素，如Pb，Cu×Pb，Zn×Pb與脲酶活性之間無顯著差異。然而，在95%置信區間下，除了Zn×Pb，其他因素與堿性磷酸酶活性之間均有明顯差異。圖1~3是添加到土壤樣品中重金屬濃度與土壤酶活性之間的關系圖。從圖1可以看出，樣品的三種土壤酶活性都比參考樣品(沒有添加外源重金屬)酶活性低。Cu對脲酶和堿性磷酸酶活性影響具有相同的規律，即隨著Cu濃度的增加，土壤酶活性顯著降低，并且在Cu濃度從100增加到400mg•kg-1時，堿性磷酸酶活性急劇下降。Cu濃度為400mg•kg-1時，脲酶活性和堿性磷酸酶活性分別是對照樣品酶活性的49%和56%。當Cu濃度小于35mg•kg-1時，轉化酶活性受到明顯抑制作用，從35增加到100mg•kg-1時，酶活性輕微降低；當Cu濃度從100增加到400mg•kg-1時，酶活性顯著降低。圖2展示的是添加Zn以后三種水解酶活性表現出的不同變化規律。在Zn的濃度為500mg•kg-1時，轉化酶活性和堿性磷酸酶活性均比對照樣品酶活性降低，分別是對照樣品酶活性的97%和91%，而脲酶活性有所增加，是對照樣品的107%。首先，低濃度的Zn抑制轉化酶活性，隨后又表現出激活特性，當Zn濃度從300增加到500mg•kg-1時，酶活性有緩慢的增加；脲酶活性表現出不同的變化趨勢，從最初顯著增加到無明顯變化。通常Zn對堿性磷酸酶活性表現出抑制作用。Zn對轉化酶活性和脲酶活性的強化效應可能與它們是金屬酶有關，并且該金屬是Zn[3]。圖3描述的是三種土壤水解酶活性對添加的外源Pb的響應。總體看，在Pb濃度為500mg•kg-1時，轉化酶活性和脲酶活性均比對照樣品升高，而堿性磷酸酶活性降低，是對照樣品酶活性的87%。在低濃度時，Pb抑制轉化酶活性，激活脲酶活性。在濃度從35增加到500mg•kg-1時，轉化酶活性隨Pb濃度增加而升高，而隨后轉化酶活性顯著降低；脲酶活性隨Pb濃度增加表現出不同的變化規律，當Pb濃度從35增加到350mg•kg-1時，酶活性降低，從350增加到500mg•kg-1時，酶活性顯著增加；Pb則是堿性磷酸酶活性的抑制劑。不同的培養時間對酶活性也有一定的影響。在7到14天時，隨培養時間的延長，轉化酶活性和堿性磷酸酶活性表現出相同的變化趨勢，即酶活性先升高，后降低。對脲酶活性而言，在第7天時有顯著降低，隨后隨時間延長緩慢降低。水解酶活性與所添加的外源污染物的量之間的多元回歸方程(式1~3)顯示的信息與以上分析結果類似。從堿性磷酸酶活性與各污染因素添加量之間的多元回歸方程可見，Cu、Zn、Pb的回歸系數分別為-2.152、-0.451及-0.831，各因素對酶活性均表現為抑制作用，并且對酶活性影響的順序是Cu＞Pb＞Zn。另外，Zn和Pb對脲酶活性表現出激活作用，而Zn對轉化酶活性幾乎沒有影響，這些結論與以前的研究成果一致，同時與方差分析的結果相符。

3討論

復合重金屬對土壤酶活性的影響早有報道。本研究發現，與其他污染物相比，Cu可明顯抑制土壤水解酶活性，并且抑制程度隨金屬Cu的含量增加而增大。Zn對轉化酶活性和脲酶活性沒有明顯作用，不過Zn濃度為100mg•kg-1時可提高脲酶活性。然而，隨著添加Zn量的增加堿性磷酸酶活性受到抑制。其實Cu、Zn和Pb對堿性磷酸酶活性均表現出抑制作用。重金屬抑制土壤酶活性的機理有幾種方式，包括使酶的催化活性基團失活、使蛋白質變性以及與那些形成酶-底物復合物所必需的金屬離子競爭等[15]。Wang等發現土壤磷酸酶活性與金屬Cu之間呈顯著的負相關關系。Khan等指出重金屬可與酶的巰基反應，形成金屬-硫化物等同物進而抑制和/或使酶活性失活。抑制劑可通過改變酶的分子結構進而抑制脲酶活性。另外一些學者研究認為當重金屬含量達到2000mg•kg-1時，脲酶活性可完全消失。Zeng等也指出，通常在特定的環境條件下，某些元素的含量超過某一范圍時會對植被和微生物帶來負面效應。另外，不同種類的酶對重金屬含量變化帶來的響應也不同。這可能取決于酶的靈敏度、酶結構上的抑制以及季節影響。同時，土壤因素，如pH、土壤有機質含量和粘土礦物成分也會有一定的影響。Wyszkowska等指出土壤酶活性對重金屬影響的靈敏度排序是脫氫酶＞脲酶＞堿性磷酸酶。當重金屬進入土壤，它們可以改變土壤pH值，一般是導致土壤酸化。Renella等認為在堿性土壤中，酸性磷酸酶活性更易受影響，而堿性磷酸酶活性在酸性土壤中更易受影響。除此之外，重金屬抑制土壤酶活性的機理可能是鈍化催化活性基團，與那些可以形成酶-底物復合物的重金屬離子競爭，或者是使蛋白質成分失活。培養時間對三種土壤水解酶活性也表現出不同的影響。不過在第35天時所有的土壤酶活性均比第3天時低，這個結果與Naidu等的結論一致，即隨著重金屬在土壤中時間的延長，重金屬的生物可利用性降低。因為重金屬的生物利用率是土壤酶活性的主要來源，有其是對土壤微生物和植物。當三種重金屬同時存在時，他們對酶活性影響的強度并不是他們單獨存在時對酶活性影響程度之和，這可能是與同一個實驗中的三種重金屬之間發生了相互作用有關。在我們國家，土壤中重金屬的主要來源有污水灌溉、工業廢棄物堆放、城市固體垃圾堆放以及大氣沉降等。劉樹慶發現在保定市污水灌溉的農田中Zn、Cu、Pb和Cd的含量非常高，并且隨著持續的污水灌溉金屬含量一直在增加。另外，由于土壤存在多種重金屬復合污染，其中種植的蔬菜也應經被污染。在該研究中，很少有人指出土壤中Cu、Zn、Pb的含量已接近污染的水平。有交互作用的實驗結果顯示，三種重金屬復合效應對堿性磷酸酶活性影響最顯著，尤其是Cu×Pb，其次是Cu×Zn。不過它們的這些影響都不及Cu單獨存在時顯著。Wyszkowska等曾有過類似的報道，他發現當Cu與其他重金屬（如Zn、Pb、Cd和Cr）同時存在時，它對土壤酶活性的抑制作用比它單獨存在時弱。對于此現象，其他解釋是當兩種重金屬同時作用時(Cu×Zn,Cu×Pb)，Zn或Pb對土壤酶活性有保護作用。與Zn、Pb的自主效應比較，兩者的復合效應降低了，這說明它們對堿性磷酸酶活性的影響具有拮抗作用。盡管Cu或Zn對轉化酶活性有輕微影響并且沒有統計顯著性，不過它們的復合效應影響增加了，這說明在它們的二元系統中存在協同效應。不過，二元系統對堿性磷酸酶活性的抑制作用沒有它們單獨存在時顯著，這可能是由于二者之間存在負的協同抑制效應。總之，添加的Cu、Zn、Pb對研究的三種土壤水解酶活性均呈現不同的影響。土壤酶活性被抑制或激活的程度隨重金屬種類及其濃度以及土壤酶種類的不同而有差異。一些學者報道土壤酶受到抑制或激活的程度順序與眾多因素有關，包括重金屬種類、重金屬濃度、分析的土壤酶種類；溶液中重金屬與土壤酶官能團之間的反應；重金屬之間的反應；土壤的理化性質，如pH、陽離子交換量、有機質含量，以及粘土礦物種類和含量等。這些過程可能導致土壤中不同重金屬對土壤酶活性抑制或激活效應的不同。這些結果與其他的一些將土壤酶活性作為土壤重金屬污染指示劑的研究結論一致。

4結論

以正交實驗設計方案為基礎的該研究證實了土壤中添加的外源重金屬Cu、Zn、Pb，不管是三者的復合作用還是兩兩之間的相互作用，都對土壤水解酶活性產生了影響。(1)當Cu、Zn、Pb三種重金屬同時存在土壤樣品中時，金屬Cu對三種土壤水解酶活性的抑制作用較其他兩種金屬顯著，對堿性磷酸酶抑制作用的排序是Cu＞Zn＞Pb。(2)考慮三種土壤水解酶，在本研究中堿性磷酸酶活性對三種重金屬的交互作用影響反應最敏感，尤其是Cu×Pb，因此可以考慮將堿性磷酸酶活性作為土壤重金屬Cu污染程度的指示劑。

作者：馮丹 王金生 滕彥國 單位：北京師范大學水科學研究院 地下水污染控制與修復教育部工程研究中心