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《植物保護(hù)學(xué)報(bào)》2016年第二期

摘要:

為探索柑橘黃化脈明病毒引起的柑橘新病害—柑橘黃脈病的早期快速檢測(cè)技術(shù)，針對(duì)CYVCV核酸結(jié)合蛋白基因的保守序列設(shè)計(jì)2對(duì)特異性引物，通過優(yōu)化退火溫度，建立了CYVCV巢式RT-PCR檢測(cè)方法，并對(duì)采自不同柑橘品種的54個(gè)CYVCV疑似樣品進(jìn)行了檢測(cè)。結(jié)果表明，CYVCV巢式RT-PCR檢測(cè)中，以55℃和60℃分別作為第1輪和第2輪擴(kuò)增的退火溫度時(shí)檢測(cè)效果最佳;該方法檢測(cè)樣品中病毒總核酸的最低濃度為2.40μg/L，靈敏度較RT-PCR提高100倍。在CYVCV疑似樣品檢測(cè)中，巢式RT-PCR和RT-PCR的陽(yáng)性檢出率分別為59.26%和57.41%，前者更適用于檢測(cè)不同來源的CYVCV。當(dāng)尤力克檸檬、錦橙北碚-447、天草和臺(tái)灣椪柑嫁接接種CYVCV后，巢式RT-PCR比RT-PCR提前10～30d檢測(cè)出病毒。表明所建立的CYVCV巢式RT-PCR檢測(cè)方法適用于田間病樹的早期診斷。

關(guān)鍵詞:

柑橘黃化脈明病毒;巢式RT-PCR;檢測(cè)

柑橘黃脈病是由柑橘黃化脈明病毒引起的一種新的柑橘病害。該病最早發(fā)現(xiàn)于巴基斯坦，隨后在印度、土耳其、中國(guó)等國(guó)家相繼被報(bào)道。該病能夠危害大多數(shù)柑橘種類，其中檸檬和酸橙對(duì)此病最為敏感，甜橙較為耐病，寬皮柑橘、葡萄柚、香櫞和墨西哥萊檬等最為耐病。植株感染此病后葉脈黃化、透明，葉片脫落，產(chǎn)量降低，甚至絕收(Cataraetal．，1993;nelgeetal．，2010)。目前該病已對(duì)我國(guó)柑橘產(chǎn)業(yè)，尤其是檸檬生產(chǎn)造成了嚴(yán)重?fù)p失，且發(fā)生范圍逐漸擴(kuò)大(周常勇等，2013;陳洪明等，2015)。CYVCV為柑橘病毒屬M(fèi)andarivirus成員，病毒粒子呈彎曲線狀，大小約為670～700nm×13～14nm。CYVCV基因組含有7529個(gè)核苷酸，可能包含有6個(gè)開放閱讀框。CYVCV除可以通過嫁接傳播外，還能通過豆蚜A-phiscraccivoraKoch和繡線菊蚜A．spiraecolaPatch在檸檬和菜豆間進(jìn)行傳播(nelgeetal．，2011)，因此，豇豆、菜豆、辣椒、藜麥等也是柑橘黃脈病的草本寄主。但目前尚不清楚CYVCV是通過何種媒介昆蟲在柑橘間進(jìn)行傳播，通過防治媒介昆蟲來防控柑橘黃脈病尚不可行。柑橘黃脈病是我國(guó)新生病害，目前尚缺乏有效防治該病的藥劑，因此種植無病毒苗木和加強(qiáng)病毒檢測(cè)成為防治該病的重要途徑，建立快速、靈敏的病毒檢測(cè)技術(shù)是當(dāng)前柑橘黃脈病防治的首要任務(wù)。CYVCV的檢測(cè)鑒定通常以檸檬和酸橙作為指示植物，但檢測(cè)周期長(zhǎng)，需2～3個(gè)月，且需要進(jìn)行隔離處理。Cataraetal．(1993)曾通過電鏡技術(shù)檢測(cè)CYVCV，但操作較為繁瑣，且僅適用于部分柑橘品種的檢測(cè)。近年來，Alshamietal．(2003)和Chenetal．(2014)相繼建立的血清學(xué)和RT-PCR檢測(cè)方法，縮短了CYVCV的檢測(cè)時(shí)間。但對(duì)大量CYVCV疑似樣品進(jìn)行檢測(cè)時(shí)，這些方法在靈敏度和檢測(cè)范圍上存在不足。因此，本研究通過建立CYVCV的巢式RT-PCR檢測(cè)方法，以期進(jìn)一步提高檢測(cè)范圍和準(zhǔn)確性，以滿足當(dāng)前柑橘生產(chǎn)中CYVCV快速檢測(cè)的需要。

1材料與方法

1.1材料供試毒源及植物樣品:感染了CYVCV、柑橘衰退病毒、柑橘碎葉病毒、柑橘裂皮病類病毒、溫州蜜柑萎縮病毒、柑橘鱗皮病病毒、柑橘黃龍病的病株，2年生無病毒尤力克檸檬Citrusli-mon、錦橙C．sinensis北碚-447、天草C．reticulata×C．sinensis和臺(tái)灣椪柑C．poonensis實(shí)生苗，以及柑橘潰瘍病的總核酸提取物均由西南大學(xué)柑橘研究所脫毒中心提供。所有植物分別置于不同的20～25℃隔離溫室中生長(zhǎng)備用。供試54份疑似樣品采自四川、重慶、云南、江西、湖南、福建等地的甜橙、柚、寬皮柑橘、雜柑、檸檬、葡萄柚和枳類等柑橘上。

引物:根據(jù)GenBank中CYVCV土耳其分離株Y1(JX040635.1)的基因組序列，針對(duì)其3'端保守的核酸結(jié)合蛋白基因運(yùn)用Oligo6.0生物學(xué)軟件設(shè)計(jì)2對(duì)引物。其中外巢引物中上游引物為CYVCV-1f:5'-ATCATGAGTTCCATACCACTCGAG-3'，下游引物為CYVCV-1r:5'-AAATATTCAGGCTTTCAGTTT-3'，預(yù)期擴(kuò)增片段長(zhǎng)度為704bp。內(nèi)巢引物中上游引物為CYVCV-2f:5'-AAACCTAATCGGTCCTGTG-3'，下游引物為CYVCV-2r:5'-GAGACACCCTACTTCAGCG-3'，預(yù)期擴(kuò)增片段長(zhǎng)度為469bp。Chenetal．(2014)建立的RT-PCR所用上游引物為VF-1:5'-TACCGCAGC-TATCCATTTCC-3';下游引物為VR-1:5'-GCAGAAATC-CCGAACCACTA-3'。所有引物均由英濰捷基(上海)貿(mào)易有限公司合成。培養(yǎng)基及試劑:LB(Luria-Bertani)液體培養(yǎng)基:1%氯化鈉、0.5%酵母提取液、1%蛋白胨。Prim-Script1StepEnzymeMix、ExTaqDNA聚合酶、膠純化試劑盒、pMD19-T載體、感受態(tài)細(xì)胞JM-109和質(zhì)粒純化提取試劑盒等均購(gòu)于寶生物工程(大連)有限公司;限制性內(nèi)切酶XmaI和HindIII購(gòu)于美國(guó)NEB公司;SephadexG-50-80購(gòu)于美國(guó)GEHealth-care公司;其余試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。儀器:VarioskanFlash核酸讀數(shù)系統(tǒng)，美國(guó)ThermoScientific公司;TGRADIENT型PCR儀，美國(guó)WhatMan公司。

1.2方法

1.2.1CYVCV病毒總核酸的提取選取5～10mgCYVCV病株的葉片，液氮中研磨后加入60μLTES緩沖液和60μL飽和酚∶氯仿∶異戊醇(25∶24∶1)。混勻后70℃水浴5～10min。將上清液用由SephadexG-50-80構(gòu)成的微柱過濾后在－20℃保存?zhèn)溆?周常勇等，2001)。1.2.2退火溫度的優(yōu)化第1輪RT-PCR擴(kuò)增:將1μLCYVCV病株的總核酸與1μL無菌水混合，95℃解鏈3min，冰浴后依次加入5μmol/L外巢引物CYVCV-1f/CYVCV-1r各0.5μL、2×1StepBuffer5μL、PrimScript1StepEnzymeMix0.4μL，無菌水補(bǔ)足至10μL。反應(yīng)條件為:50℃30min，94℃2min;94℃30s，退火(溫度設(shè)置49、51、53、55、57、59℃)30s，72℃45s，循環(huán)15次;72℃延伸5min。第2輪PCR擴(kuò)增:取1μL第1輪擴(kuò)增產(chǎn)物，依次加入5μmol/L內(nèi)巢引物CYVCV-2f/CYVCV-2r各1μL、10×PCR緩沖液2.5μL、5U/μLExTaqDNA聚合酶0.2μL，無菌水補(bǔ)足至25μL。反應(yīng)條件為:94℃2min;94℃30s，退火(溫度設(shè)置56、58、60、62、64、66℃)30s，72℃45s，循環(huán)30次;72℃5min。

1.2.3巢式RT-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的檢測(cè)及鑒定將巢式RT-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的目的片段切膠純化回收后與pMD19-T載體于4℃連接過夜，并轉(zhuǎn)化感受態(tài)菌株JM-109。挑取單個(gè)的轉(zhuǎn)化菌落，加LB液體培養(yǎng)基培養(yǎng)24h后用質(zhì)粒純化提取試劑盒提取質(zhì)粒DNA。質(zhì)粒DNA經(jīng)限制性內(nèi)切酶XmaI和HindIII雙酶切鑒定后，將陽(yáng)性克隆送英濰捷基(上海)貿(mào)易有限公司進(jìn)行測(cè)序鑒定。測(cè)序結(jié)果與CYVCV土耳其分離株Y1(JX040635.1)的相應(yīng)序列進(jìn)行BLAST比對(duì)分析。

1.2.4巢式RT-PCR特異性及靈敏度檢測(cè)按照1.2.1的方法分別提取感染了CTV、CTLV、SDV、CEVd、CPV、CYVCV和HLB的病株的總核酸，并將其與本課題組保存的潰瘍病總核酸用已建立的巢式RT-PCR方法進(jìn)行檢測(cè)。按照1.2.1方法提取黃脈病病株樣品的總核酸，使用核酸讀數(shù)系統(tǒng)測(cè)定其A260/A280比值和總核酸濃度。用無菌水按10倍梯度將獲得的總核酸稀釋至107倍，并以此為模板，分別按照上述的巢式RT-PCR，以及Chenetal．(2014)建立的RT-PCR方法進(jìn)行檢測(cè)。

1.2.5巢式RT-PCR和RT-PCR檢測(cè)效果比較采用RT-PCR和巢式RT-PCR法分別檢測(cè)采自甜橙、柚、寬皮柑橘、雜柑、檸檬、葡萄柚和枳類等柑橘上的54個(gè)CYVCV疑似樣品。為保證檢測(cè)的可靠性，每種方法均以CYVCV病株和健康植株作為正負(fù)對(duì)照。將檢測(cè)結(jié)果不一致的樣品嫁接接種于2年生無病毒尤力克檸檬實(shí)生苗，置于25～28℃隔離溫室中保存。接種2～3個(gè)月后觀察新梢癥狀。選取CYVCV分離株AY1分別嫁接接種于2年生無病毒的尤力克檸檬、錦橙北碚-447、天草和臺(tái)灣椪柑。每個(gè)品種嫁接10株，每株嫁接2塊皮和1個(gè)芽。嫁接后置于25～28℃隔離溫室保存。嫁接后每10d提取1次總核酸，總共提取8次。每次按照周常勇等(2001)的方法從4個(gè)方向提取葉片中的總核酸，并將同一植株4個(gè)方向提取的總核酸混合后分別進(jìn)行巢式RT-PCR和RT-PCR檢測(cè)。

2結(jié)果與分析

2.1退火溫度的優(yōu)化及擴(kuò)增產(chǎn)物的鑒定第1輪RT-PCR擴(kuò)增中，退火溫度為49、51、53、55、57℃時(shí)均能擴(kuò)增出704bp的目標(biāo)片段，但57℃時(shí)目標(biāo)片段較弱，因此選用55℃作為最佳退火溫度。第2輪擴(kuò)增中，退火溫度為56、58、60、62、64、66℃時(shí)均能擴(kuò)增出469bp的目標(biāo)片段，除62、64、66℃時(shí)擴(kuò)增的條帶亮度較弱外，其余條帶亮度基本一致，且在58℃和60℃時(shí)沒有出現(xiàn)非特異性擴(kuò)增，因此選用60℃作為第2輪最佳退火溫度。獲得的質(zhì)粒DNA經(jīng)雙酶切鑒定后，與預(yù)期大小相符。陽(yáng)性菌液的測(cè)序結(jié)果經(jīng)BLAST比對(duì)分析表明，插入片段與CYVCV毒株Y1(JX040635.1)序列相似性為100%。表明該擴(kuò)增產(chǎn)物為CYVCV。

2.2巢式RT-PCR特異性檢測(cè)建立的巢式RT-PCR方法能從來自柑橘黃脈病樣品的總核酸中擴(kuò)增出469bp的特征條帶。該方法在檢測(cè)來自柑橘衰退病、柑橘碎葉病、溫州蜜柑萎縮病、裂皮病、鱗皮病和黃龍病病株的總核酸，以及保存的潰瘍病菌總核酸時(shí)均不能產(chǎn)生特征條帶(圖1)。

2.3巢式RT-PCR靈敏度檢測(cè)提取樣品總核酸的A260/A280平均值為1.93，其濃度為239.71mg/μL。檢測(cè)結(jié)果顯示，巢式RT-PCR能夠檢測(cè)到105倍稀釋的模板，濃度約為2.40μg/L。RT-PCR能夠檢測(cè)到103倍稀釋的模板，濃度約為240μg/μL，表明巢式RT-PCR檢測(cè)靈敏度較RT-PCR提高了100倍(圖2)。

2.4巢式RT-PCR和RT-PCR檢測(cè)效果比較RT-PCR從54個(gè)疑似樣品中檢測(cè)出了31個(gè)陽(yáng)性樣品，巢式RT-PCR不僅能檢測(cè)出這31個(gè)陽(yáng)性樣品，還從1個(gè)椪柑疑似樣品中檢測(cè)出了CYVCV，2種方法的陽(yáng)性檢出率分別為57.41%和59.26%。將RT-PCR未檢測(cè)出的椪柑疑似樣品嫁接接種于無病毒尤力克檸檬3個(gè)月后，其新梢表現(xiàn)出典型的脈明、黃化癥狀，證實(shí)該樣品感染了CYVCV。將CYVCV分離株AY1嫁接接種于不同的柑橘品種后20d，運(yùn)用巢式RT-PCR均可檢測(cè)出CYVCV。在接種30d后，RT-PCR方可在尤力克檸檬和錦橙北碚-447上檢測(cè)出CYVCV，直至接種50d后，RT-PCR才能在臺(tái)灣椪柑上檢測(cè)出CYVCV。相比RT-PCR，巢式RT-PCR在檢測(cè)出CYVCV的時(shí)間上提前了10～30d(表1)。

3討論

柑橘黃脈病是近年來我國(guó)出現(xiàn)的一種柑橘新病害，目前尚缺乏有效的防治方法，對(duì)柑橘黃脈病的早期診斷以及對(duì)采穗母樹的監(jiān)測(cè)是保證柑橘安全生產(chǎn)的重要措施，因此快速、準(zhǔn)確、靈敏的檢測(cè)方法顯得尤為重要。而當(dāng)前通過指示植物鑒定(Cataraetal．，1993)、血清學(xué)分析(Ahlawat＆Pant，2003)、電鏡觀察(Grimaldi＆Catara，1996)等方法進(jìn)行柑橘黃脈病檢測(cè)時(shí)，操作繁瑣且檢測(cè)周期長(zhǎng)。Chenetal．(2014)建立的RT-PCR方法雖然極大地縮短了檢測(cè)時(shí)間，但是本研究結(jié)果顯示，在檢測(cè)椪柑等耐病的柑橘品種時(shí)，尤其是在植株感染CYVCV的初期，RT-PCR在檢測(cè)靈敏度等方面還存在不足。相較于常規(guī)RT-PCR，巢式RT-PCR因具有更高的檢測(cè)靈敏度和特異性，近年來被廣泛運(yùn)用于柑橘病毒病的檢測(cè)。本研究建立的CYVCV巢式RT-PCR檢測(cè)方法，可從濃度約為2.40μg/L的總核酸模板中特異性檢測(cè)出CYVCV，其靈敏度較RT-PCR提高了100倍。這與巢式RT-PCR在檢測(cè)其它柑橘病毒病時(shí)表現(xiàn)相似，如宋震等(2011)建立的巢式RT-PCR可檢測(cè)出濃度為1.27μg/L總核酸中的CTLV，其靈敏度較一步法RT-PCR提高了100倍;劉永清等(2010)和Adkar-Purushothamaetal．

(2011)報(bào)道，CTV巢式RT-PCR檢測(cè)方法的靈敏度與實(shí)時(shí)RT-PCR相當(dāng)，達(dá)13～14拷貝/μL。雖然巢式RT-PCR通過2次PCR擴(kuò)增提高了檢測(cè)的靈敏度，但是因?yàn)樵诘?輪PCR擴(kuò)增時(shí)反應(yīng)體系中同時(shí)存在2對(duì)引物，增加了發(fā)生非特異性擴(kuò)增的機(jī)率，從而對(duì)檢測(cè)結(jié)果造成嚴(yán)重干擾。為此，本研究通過提高第2輪PCR擴(kuò)增時(shí)的退火溫度，消除了非特異性擴(kuò)增的產(chǎn)生，從而保證了檢測(cè)的準(zhǔn)確性。在對(duì)54份田間疑似樣品進(jìn)行檢測(cè)時(shí)發(fā)現(xiàn)，巢式RT-PCR不僅可識(shí)別所有RT-PCR檢測(cè)為陽(yáng)性的樣品，還可以檢測(cè)出1份RT-PCR檢測(cè)為陰性、但經(jīng)指示植物鑒定確認(rèn)感染了CYVCV的椪柑樣品，因此巢式RT-PCR更適用于檢測(cè)不同來源的CYVCV株系，且其準(zhǔn)確性高于RT-PCR。此外，在進(jìn)一步檢測(cè)接種了CYVCV的尤力克檸檬、錦橙北碚-447、天草和臺(tái)灣椪柑中發(fā)現(xiàn)，巢式RT-PCR比RT-PCR可提前10～30d檢測(cè)出病毒，極大地縮短了田間樣品檢測(cè)時(shí)的“窗口期”，從而為柑橘黃脈病的早期監(jiān)測(cè)、預(yù)警以及有效防控提供了重要的技術(shù)保障。

作者：周彥 陳洪明 王雪峰 李中安 王亮 周常勇 單位：西南大學(xué)柑橘研究所 四川省安岳縣檸檬科學(xué)技術(shù)研究所