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《德州學院學報》2016年第4期

摘要：

噬菌體展示肽技術是一種特異性多肽篩選技術，它通過將隨機序列的外源DNA片段定向插入至絲狀噬菌體的相關基因后，相應的肽序會以融合蛋白的形式展示于噬菌體表面．噬菌體和特異性抗原特異性結合后將其富集后便可準確認識與相應靶位相結合的多肽序列．近年來這種技術以應用到生命科學的多個領域，尤其在抗腫瘤研究過程中，這種技術可用于腫瘤標志物的篩選、腫瘤抗原抗體庫的建立、多肽分子探針的篩選等領域．

關鍵詞：

噬菌體展示肽庫；腫瘤；腫瘤標志物；多肽分子探針

1引言

噬菌體展示技術是一種篩選與目標靶位特異結合多肽的生物技術．該技術由Smith等人［1］于1985年首創，最早發表于國際頂尖雜志《Science》．Smith等人在其論文中詳細闡述了這一新的生物技術手段．當將外源DNA片段定向插入到絲狀噬菌體的基因III后，相應的肽序列就會以融合蛋白的形式展示于衣殼蛋白表面．與特異性抗原進行親和篩選后將其富集便可準確認識與靶位相結合的多肽序列．目前，隨著生物技術的不斷發展，該項技術已日趨成熟，也已經衍生出各種類型的篩選方法，并以用于各種類型的親和篩選過程，也獲得了較多具有較好特異性的多肽分子．

2噬菌體展示技術的基本原理

噬菌體展示技術是通過基因工程技術將一定長度的隨機肽序列基因整合到噬菌體衣殼蛋白基因中，當基因表達后該多肽序列會和衣殼蛋白形成融合蛋白并將其展示于衣殼蛋白表面，從而使表型和基因型之間建立了聯系．由于隨機肽序列基因千變萬化，因而展示到衣殼蛋白表面的展示肽序列也會呈現出各種序列結構，因此，也稱之為噬菌體展示肽庫．其基本操作程序為：首先將噬菌體肽庫擴增，之后與固相化的靶蛋白共同孵育一段時間后，洗去未與靶分子結合的及親和力較弱的游離噬菌體，然后以競爭性受體或酸液強力洗滌，洗去非特異結合的噬菌體顆粒后，將特異性結合的噬菌體顆粒擴增、滴定，進行下一輪洗脫，經3～5輪篩選后，與靶分子特異結合的噬菌體顆粒得到高度富集．之后以分子生物學手段測序后分析得到蛋白基序，之后用于下一步研究．

3噬菌體肽庫技術用于腫瘤標志物的篩選

腫瘤表面標志物是一類重要的生物標記物，多數分布于腫瘤細胞表面或血液之中．因此，通過檢測相應的腫瘤標志物就可以預知患者患癌的風險．在醫學基礎研究及臨床研究過程中具有重要的意義．腫瘤標志物的篩選可以通過許多現代分析手段完成，如2D－PAGE、真核表達文庫、原核cDNA文庫等，其中噬菌體肽庫展示技術是一種比較便捷的篩選方法［2］．以噬菌體展示肽庫技術篩選腫瘤標志物的研究方向主要集中于以下兩方面：首先是以固相篩選的方法獲得與腫瘤細胞表面相關抗原相結合的特異性多肽分子，以化學手段將其與特殊的發光物質、熒光物質或放射性物質相偶聯，利用特殊儀器有望用于腫瘤的早期診斷．另一方面，通過上述方法篩選到的多肽分子本身就是腫瘤細胞表面的某種特異配體，以這種特殊配體與相應的物質偶聯可實現成像，用于腫瘤的早期診斷．DelcommenneM等人以多發性骨髓瘤細胞為靶細胞，利用噬菌體展示肽庫技術篩選到與靶細胞特異結合的人單鏈可變區抗體片段scFvsD4A4和D6B10．利用該抗體片段可以方便地發現骨髓瘤細胞表面的硫酸乙酰肝素硫酸化，所以該抗體片段有望作為一種重要的腫瘤標志物用于該腫瘤的動態監測，為更好地實現診療奠定基礎［3］．人的血清中有許多針對自身抗原的抗體，而針對腫瘤相關抗原的自身抗體可作為一類重要的生物標志物，通過血清學測試可以用來檢測腫瘤的早期發生．具有重要的診斷價值．Kelly等人［4］通過建立胰導管癌老鼠模型，以體內篩選的方法獲得了一個與人胰導管癌細胞表面抗原特異結合的多肽plectin－1，通過蛋白組學鑒定后表明該多肽為一重要的腫瘤標志物，有望可用于人胰導管癌的早期診斷．

4噬菌體展示多肽的篩選方法

在噬菌體展示技術篩選特異性多肽分子的過程中，這些肽分子可以通過一種被稱為淘選的方法得以快速的篩選，經多輪淘選后，逐漸得到具有較強特異性的噬菌體克隆，最后經測序后得到噬菌體展示肽的共有序列，所得肽具有較好的靶向特異性而被廣泛應用．最簡單的淘選程序便是通過選擇靶位、結合、洗滌、擴增直至鑒定．

4．1體外篩選

體外篩選是目前噬菌體展示技術最普遍使用的一種方法．篩選之前，靶標的確認及選擇最為重要．通常情況下可以選擇細胞、細胞表面的某些抗原、蛋白、蛋白受體甚至細胞內的某些重要靶點．得到靶標后，就可以通過選擇合適的篩選體系進行篩選．如圖1所示，在篩選開始之前首先要通過陰性吸附細胞將非特異性噬菌體排除，這樣就可以減輕后續篩選的壓力．經過第一輪后，較為特異的噬菌體顆粒得到進一步的富集．在接下來的幾輪篩選過程中，還要逐步增加洗脫的力度如逐步加大洗滌的次數、增加洗滌的時間以及在洗滌液里加入Tween等表面活性劑．最終使得親和力最強的噬菌體顆粒被篩選出來，這個過程被稱作“生物淘選”．最終經過擴增、滴定等環節，就可以用于后續的鑒定性實驗．體外篩選最主要的一種類型為全細胞淘選．這種方法需要通過常規手段培養細胞，獲得靶細胞后就可以展開篩選．全細胞淘選最主要的特點就是細胞表面的抗原較多，因而就有可能獲得較多特異性多肽分子．

4．2體內篩選

體內篩選一般要借助于動物模型．動物模型可以有效模擬活體環境，最大化地提高多肽分子與體內特定靶標的結合能力．最常用的方法是將噬菌體通過尾靜脈注射使之在實驗動物體內通過血液循環到達靶標部位，最終可以得到特異的噬菌體克隆．體內篩選最常用的動物模型為荷瘤裸鼠．首先將人源性腫瘤細胞通過皮下注射注入至裸鼠體內，待長出腫瘤塊后，選擇尾靜脈注射方式將相應的噬菌體注入至裸鼠體內，經多輪循環最終會篩選到與腫瘤組織特異結合的噬菌體克隆．經后續擴增后進一步測序并獲得其多肽序列．盡管人們普遍認為，體內篩選可以最大限度地模擬動物體內環境，因此所得的多肽分子的可開發利用價值最大．但是，體內篩選也存在一定的問題如［5］：①序列主要以RGDmotif序列為主．因為含有RGDmotif序列的多肽主要是結合于α&’3inte－grin．②篩選到的多肽主要結合于脈管系統，不會直接到達腫瘤組織．

5噬菌體展示技術在腫瘤防治中的應用途徑

利用噬菌體展示技術可以篩選得到靶向特異性多肽分子，這些多肽分子與其它標記物分子偶聯后，既可以利用其靶向性作用，也可以利用標記物分子顯示人體內病灶部位．與藥物分子偶聯后，還有望實現腫瘤的靶向分子治療，因此，具有較好的開發利用價值．

5．1噬菌體展示技術與腫瘤的分子影像學診斷

分子影像學是以現代生物工程技術為背景，在細胞和分子水平研究生命活動的規律的科學，在此技術上還可實現定性和定量的研究，以期了解相應分子的變化規律及其相互作用［6，7］．而分子影像學發展的最直接影響因素便是特異性較好的靶向分子探針的研究與開發［8，9］．利用噬菌體展示技術獲得較好的靶向多肽分子的研究較多［10］．以微陣列方法篩選可以得到前列腺癌標志物hepsin（HPN），以此標志物為靶標，以噬菌體肽庫技術篩選得到與其特異結合的多肽分子，這些多肽分子以化學方法與熒光納米顆粒偶聯后將其注入荷瘤小鼠體內，結果表明，該多肽分子可特異結合于病灶部位，利用相關儀器設備有望用于該腫瘤的分子影像診斷，具有較大的利用價值［11］．同樣，Qi等人［12］將靶向多肽分子和一種特殊的化學發光物質ECL－PB偶聯，通過特殊設備就可以特異地鑒定出人前列腺癌表面抗原．腫瘤的脈管系統對于腫瘤的增殖具有重要的生理意義，其內皮細胞上高度表達有許多特異的分子，通過該項技術可以篩選到的與這些分子特異結合的多肽分子，有望用于基礎與臨床研究．VPAC1受體是一個與血管生成密切相關的受體家族成員，研究表明，它的過度表達直接影響著惡性腫瘤的增殖與遷移活動．因此，如果以該受體為重要靶標，篩選與其特異結合的多肽分子，則有望用于該腫瘤的分子影像學診斷．Tang等人利用該技術篩選到一個VP－2肽，研究結果表明該肽能夠與多種類型的結腸癌細胞受體特異結合．因此，標記后該肽有望作為一種重要的靶向分子探針應用于腫瘤的早期分子影像學診斷［13］．整合素是分布于細胞表面的一類異源多聚糖蛋白家族成員，它的存在直接影響著細胞與細胞之間、細胞與基質之間的相互作用．αvβ3整聯蛋白是細胞膜上一個重要的膜受體蛋白，它扮演著多種重要的生理功能，如腫瘤的侵襲、腫瘤細胞的惡性增殖、轉移以及血管的生成、炎癥的發生、骨質疏松及風濕性關節炎等疾病的發生、發展．有報道表明，有一類重要的含有三肽基序Arg－Gly－Asp的多肽分子可以特異結合于αvβ3和αvβ6分子．而αvβ6是一種典型的蛋白分子，它在多種腫瘤中均高度表達，當將這些具有典型基序的多肽分子與同位素等標記物分子相偶聯后，就有望作為一種重要的分子探針用于腫瘤的早期診斷［14］．CGLIIQKNEC是一個應用該技術篩選得到的多肽分子，研究表明它可以特異結合于纖連蛋白的環狀多肽，當該肽與Gd－DTPA偶聯后形成的復合物能夠在腫瘤組織中高度富集，有望用于分子成像［15］．綜上所述，靶向多肽分子可以作為載體分子，通過和某些影像標記物如熒光、放射性物質、納米顆粒等結合后，在病灶部位就能夠通過儀器檢測到相應信號，應用于臨床后有望用于靶向診斷和治療［16］．因此，具有靈敏、便捷的特點．但是，由于腫瘤發生的復雜性導致所產生的標志物具有較大的可變性，與多肽分子有關探針也未見任何報道，因此對于這方面的研究還需繼續深入研究，其可發利用空間巨大、前景誘人．相信隨著基礎醫學及分子生物學技術的不斷發展，多肽分子探針用以腫瘤的早期診斷可以變為現實．

5．2噬菌體展示技術與靶向藥物的開發

一些大分子物質如抗體可以作為重要的抗腫瘤藥物用于癌癥的治療和靶向藥物分子的遞送．但是抗體作為藥物載體具有諸多不利條件．如：分子較大不易穿透腫瘤組織，另外，部分抗體還可引起較強的免疫反應，而且還會積累于肝臟和網狀內皮組織系統［17］．靶向分子多肽是一類具有較強應用價值的分子，這種分子應用于藥物開發主要通過以下兩種方式：其一是利用它作為載體分子，將藥物分子與其偶聯后借助于多肽分子的靶向作用將其遞送到相應的病灶部位，起到治療作用．生腱蛋白是一類在腫瘤組織相關基質中高表達的特殊蛋白質．Kim等利用噬菌體展示技術獲得了與該蛋白特異結合的多肽分子，研究結果表明，這種多肽分子具有較好的靶向特異性，有望作為一種重要的載體分子用于靶向藥物治療［18］．部分多肽分子除了具有較好的靶向作用外，還具有一定的抗腫瘤功效，一方面表現出細胞毒活性，另一方面，作為一種重要的調節物質作用于細胞的信號通路，通過促發某些重要蛋白和受體來促進細胞凋亡．有研究報道，多肽分子sp22是一個與CD95特異性結合的分子，研究結果表明，該分子不僅能夠有效抑制CD95的表達，而且還能引起補體介導的細胞自溶以及啟動凋亡信號促使細胞凋亡，在靶向藥物開發方面具有重要意義［19］．靶向多肽HSQAAVP能夠對成纖維生長因子8b誘導的細胞惡性增殖具有較強的抑制作用，其主要機理是通過通過抑制Cyc－linD1和PCNA進而產生周期阻滯效應，同時對于Erk1／2和Akt的級聯效應也具有抑制作用．因此，該肽在前列腺癌的藥物防治方面具有重要的開發價值［20］．PTPRJ是一個酪氨酸磷酸酶蛋白受體，在腫瘤組織中表達較少，PaduanoF等人［21］以噬菌體展示技術篩選到一個特異性多肽分子，該分子能夠激活PTPRJ．研究結果表明，該激活肽能夠顯著降低培養細胞的MAPK磷酸化水平和酪氨酸水平磷酸化．而且能夠促進細胞周期抑制劑P27的高表達．降低腫瘤細胞的惡性增殖并引起細胞凋亡．因此，該激活肽可以作為一種新的分子有望用于靶向治療過程．當然，多肽分子抗腫瘤也存在一定的缺陷，多肽分子的穩定性較差，在生物體內容易被降解，但通過理化修飾便可獲得較好活性的生物分子．Mier等人報道了一個利用噬菌體展示技術獲得的多肽分子FROP－DOTA．將該肽與PEG偶聯后，該肽穩定性進一步增強、在腫瘤組織中的積累增加，大大地提高了其可利用價值［22］．

作者:王瀚 趙淑玲 卓平清 單位:隴南師范高等專科學校生命科學與技術系