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《生態科學雜志》2015年第六期

【摘要】

在標準化的大型溞繁殖試驗中探討食物濃度的合適表征指標和研究不同食物濃度對大型溞生長和繁殖的影響。結果表明:分別采用細胞計數法、光密度法和總有機碳分析法測定的斜生柵藻液細胞數量、吸光度和總有機碳濃度三者兩兩之間的線性方程相關系數r均大于0.917(P<0.01),線性相關性顯著,三個指標有明顯的可比性。從操作的角度考慮,光密度法最為簡便,然而為體現不同種類食物提供的能量水平差異,以總有機碳濃度表征食物的濃度最為合適。幼溞的數量是反映親溞繁殖能力的主要指標,設置的0.01、0.05、0.10、0.15、0.20和0.30mgC•(溞•d)–1食物濃度組所產幼溞數量的平均值和標準差分別為33、6810、11816、16415、20522和23120,表明隨著食物濃度的增加,親溞繁殖幼溞的數量也相應增加,且在不同食物濃度組之間均存在顯著性的差異(P<0.05)。當喂食濃度達到0.05mgC•(溞•d)–1時,親溞繁殖幼溞數量的平均值即能達到60只(大型溞繁殖試驗的質量控制要求之一),因此,對于易吸附于藻細胞或被藻細胞降解的化學物質,大型溞繁殖試驗中可調整食物濃度為0.05—0.1mgC•(溞•d)–1,有利于受試物暴露濃度的維持。

關鍵詞：

大型溞;斜生柵藻;食物濃度;生長;繁殖

1前言

大型溞(Daphniamagna)屬節肢動物門(Arthropoda)、甲殼動物綱(Crustacea),在世界范圍分布廣泛[1],處在水生生態系統食物鏈的第二級(初級消費者),具有重要的生態學地位。大型溞體形小、易于實驗操作和繁殖、全年可獲得,主要以孤雌生殖方式進行繁殖,易于得到基因型一致的單克隆個體,對有毒物質敏感性高[2],被作為標準測試生物廣泛應用于有毒物質在生態毒理學上的急性和慢性毒性研究[3]。標準化的大型溞繁殖試驗測試結果是歐盟REACH(Registration,Evaluation,Authization,andRestrictionofChemicals)法規中產量超過10噸•年1的化學品必需提供的慢性毒性數據,也是我國新化學物質注冊登記中二級及以上申報應提交的慢性毒性數據。經濟合作與發展組織(ganizationfEconomicCo–operationandDevelopment,OECD)經過一系列的對比試驗,在1998年更新的化學品測試指南-大型溞繁殖試驗導則(OECD211)中推薦使用經過基因型鑒定的大型溞品系(如來源于法國IRCHA的品系A)作為受試生物,且要求在0.1—0.2mgC•(溞•d)–1的食物濃度下,需滿足試驗期間空白對照組存活親溞所產幼溞的平均值不少于60只的質量控制要求[4]。上述內容,盡管經過2008年至2012年的多次改版更新也一直維持不變[5–6]。

為大型溞提供碳源的食物通常為淡水藻類細胞,如小球藻(Chlellasp.)、羊角月牙藻(Selenatrumcapricnutum)和柵藻(Scenedesumssubspicatus)[6–7]。食物濃度是影響溞類繁殖的重要因素之一[8–9],在適當的食物濃度范圍內,提供的食物濃度越高親溞產幼溞的數量就越多[8,10],更容易滿足空白對照組親溞所產幼溞數量的質控要求。但是在化學品測試中,藻細胞可吸附某些化學物質甚至對化學物質具有降解性[11–16],過高的食物濃度將導致受試物暴露濃度下降,無法在試驗期間維持穩定。此外,高濃度的食物也會使試驗溶液變得渾濁、減少了親溞的活動空間,可能會影響親溞的生長和繁殖。本研究以分離自中國本土水生環境的大型溞作為受試生物,通過設計一組不同食物濃度水平的試驗,考察不同食物濃度組中大型溞的生長和繁殖情況,并將其與質控要求進行對比,對標準推薦的食物濃度范圍進行驗證和優化。過去,國內外大型溞繁殖的相關研究中大多以細胞數量•mL–1表示食物濃度[17–21],而OECD、ISO和國內的化學品測試方法[6,22–23]中,大型溞繁殖試驗均要求以mgC•(溞•d)–1來表示食物濃度。因此,為了提高來自不同地區和實驗室的研究數據的可比性,提高風險評估時數據的可利用性,本研究對國內廣泛采用作食物的斜生柵藻(Scenedesmusobliquus)液的細胞數量、吸光度和總有機碳(TOC)濃度之間的相互關系也作出有意義的探討。

2材料和方法

2.1供試生物大型溞(Daphniamagna),引自沈陽化工研究院安全評價中心,分離于國內的水生環境。大型溞在實驗室進行長期的培養和繁殖,試驗前,在試驗條件下馴養了3代以上。馴養過程中,采用ElendtM4培養基,每周更換3次,并投以濃縮的斜生柵藻液作為食物。選擇出生小于24h的幼溞作為試驗的親溞用于試驗。

2.2食物斜生柵藻(Scenedesmusobliquus),購自中國科學院野生生物種質庫——淡水藻種庫。在經過滅菌的OECD201培養基[11]中接入斜生柵藻種,在23℃±2℃、約5000lx連續光照的條件下培養,收集處于對數生長期或穩定期的藻液,經過8000r•min–1離心5min,收集藻細胞,再用去離子水懸浮,定量投喂于大型溞馴養容器中。

2.3試驗用水試驗用水為OECD、ISO和國內的化學品測試方法[6,22–23]推薦的ElendtM4培養基。pH值范圍在7.59—8.65之間、總硬度(以CaCO3計)范圍在220—270mg•L–1之間、溶解氧濃度范圍在9.0—9.7mg•L–1之間。

2.4試驗條件溫度:20℃±1℃;光照周期:16h光照/8h黑暗;光照強度:600lx—1200lx;承載量為1只親溞•80mL培養基–1。

2.5藻液中細胞數量、吸光值與總有機碳(TOC)的測定方法離心收集獲得的藻細胞,加入去離子水懸浮和洗滌2—3次,最后加入適量的去離子水懸浮得到藻細胞濃縮液。用去離子水稀釋藻細胞濃縮液,得到5個不同稀釋倍數的藻細胞稀釋液,標記為1—5。以去離子水調零,采用T6紫外–可見分光光度計測定各樣品在波長440nm下的吸光值和采用LiquiTOCⅡ型總有機碳/總氮分析儀測定各樣品的TOC濃度,同時,在光學顯微鏡下對各樣品中藻細胞的數量進行計數。

2.6大型溞繁殖試驗方法依據OECD、ISO和國內的化學品測試方法的大型溞繁殖試驗方法[6,22–23],試驗設置6個食物濃度組,分別為T10.01mgC•(溞•d)–1、T20.05mgC•(溞•d)–1、T30.10mgC•(溞•d)–1、T40.15mgC•(溞•d)–1、T50.20mgC•(溞•d)–1和T60.30mgC•(溞•d)–1。每個食物濃度組設置10個平行(容器),每個平行含1只親溞和80mLElendtM4培養基。試驗期間,各食物濃度組每天投喂相應濃度的藻細胞濃縮液,每2天更新一次ElendtM4培養基。試驗期間,每天觀察親溞的外觀和存活情況,及時移除產生的幼溞并計算存活幼溞的數量,記錄親溞的死亡率、所產幼溞的數量、初次生殖時間和總生殖胎數。試驗結束時,測定所有存活親溞的體長。

2.7數據處理采用OfficeExcel2007軟件進行線性回歸的分析。采用SPSS16.0軟件進行單因素方差分析和多重比較(LSD法),統計顯著水平設定為P<0.05。

3結果

3.1藻液細胞數量、吸光度與總有機碳(TOC)濃度之間的線性關系分析結果見表1和表2。各線性方程的相關系數r均大于0.917(P<0.01),說明采用細胞計數法、光密度法和總有機碳分析法測定的藻液細胞數量、吸光度和總有機碳濃度之間的線性相關性極顯著,三種測定結果有明顯的可比性。

3.2大型溞繁殖試驗結果

3.2.1親溞的死亡率試驗結果見表3。各組親溞的死亡率均滿足≤20%的試驗有效性要求。經過Cochran–Armitage趨勢檢驗,結果顯示,各組的親溞死亡率不遵循濃度–效應模型,也就是說在0.01—0.30mgC•(溞•d)–1的食物濃度范圍對親溞的死亡并無造成顯著影響[6]。可判斷T1和T5組的親溞死亡為偶然因素引起的,因此,在親溞所產存活幼溞數量的結果分析中排除死亡親溞所產的幼溞數[6]。

3.2.2存活親溞的體長試驗結果見表3和圖1。經方差分析和多重比較(LSD法),表明除了T5與T6組之間存活親溞體長的平均值無顯著性差異(P>0.05)之外,其余各組之間存活親溞體長的平均值均存在顯著性差異(P<0.05)。說明食物的濃度也可顯著地影響大型溞的體長增長。

3.2.3親溞所產幼溞的數量試驗結果見表3和圖2。試驗期間,各組親溞所產幼溞都沒有出現死亡的現象。經方差分析和多重比較(LSD法),結果表明,各組所產幼溞的數量之間均存在顯著性差異(P<0.05)。說明在本研究的食物濃度范圍內,隨著食物濃度的增加,親溞繁殖幼溞的數量也相應增加。當喂食濃度達到0.05mgC•(溞•d)–1時,親溞繁殖幼溞數量的平均值即能達到大于60只。另外,除了T1組,其它組親溞所產幼溞數量的平均值的變異系數范圍為8.4%—13.8%,均小于25%,說明整個試驗體系的運行良好[6,23]。

3.2.4親溞的體色、初次生殖時間和總生殖胎數試驗結果見表3。為了讓低食物濃度組(如T2)親溞的總繁殖胎數盡可能達到5胎,試驗延長了1天,總試驗天數為22天。試驗期間,T1組親溞體色變白,生長緩慢,懷卵量少或不懷卵,表明食物嚴重缺乏導致大型溞的代謝、生長和生殖異常[24–25],而T2–6組親溞的體色均正常。同時,T1組親溞的初次生殖時間和總生殖胎數與T2–6組相比存在顯著性差異(P<0.05),但是,T2–6組親溞的初次生殖時間和總生殖胎數之間無顯著性差異(P>0.05)。說明當食物濃度低于0.05mgC•(溞•d)–1可能會顯著延遲大型溞的生殖時間間隔[24]。

4討論

4.1食物濃度的合適表征指標和定量分析方法基于生態系統的能量流動理論[26],在大型溞繁殖試驗體系中,大型溞的繁殖能力與試驗體系中的能量輸入直接相關,也就是說食物提供的能量決定了大型溞的繁殖能力。細胞計數法是藻類生物量的基本測定方法,是確定其它測定方法是否有效的依據[27–28]。但是,不同藻種的細胞大小不同,營養組成和含量也會存在差異[29],因此,細胞數量并不能準確表征不同種類食物的能量差異[30]。藻液的總有機碳濃度被認為是表征藻液能量水平差異的合適指標[7,30]。藻液的總有機碳濃度測定需要較高的成本和消耗較長的時間。在本研究中,斜生柵藻液不同稀釋倍數的稀釋液中的細胞數量、吸光度和總有機碳濃度三者兩兩之間的線性方程具有良好的線性相關性,表明可用細胞計數法和光密度法準確、間接地測定藻液的總有機碳濃度。但是,細胞計數法易受人為因素的影響,且在細胞密度過低或過高時誤差較大,相比較而言,光密度法比細胞計數法更為簡便、準確和高效,這與孫欣、黃美玲研究的結論是一致的[27–28]。另外,由于不同藻種的細胞形狀、大小不同,營養組成和含量也會存在差異[29],因此,不同藻液的細胞數量或吸光度與總有機碳濃度的線性方程也應該會不同[30]。根據本研究中斜生柵藻的細胞數量與總有機碳濃度之間的線性方程,可以比較同樣以斜生柵藻為食物的大型溞慢性毒性研究之間由于食物濃度的不同而帶來的差異。如熊勤犁等以每天投放濃度為90000個•mL–1的斜生柵藻[以方程Y=0.2638X+1.8383計算,相當于0.33mgC•(溞•d)–1的食物濃度]研究大型溞的慢性毒性,空白對照組每只親溞產幼溞數量的平均值和標準差為161±19[31],與本研究結果存在有一定的差異,可能與試驗條件不完全相同或者采用的溞種基因型存在差異相關[32]。

4.2食物濃度與大型溞的生長和繁殖的關系

4.2.1不同食物濃度對大型溞體長的影響本研究表明,隨著食物濃度的增加,大型溞的體長也相應地增長[24–25]。但是,當食物物濃度達到0.2mgC•(溞•d)–1時,大型溞的體長就基本達到最大值4.26mm左右,此時,即使再提高食物濃度也不會使其體長顯著增長。此結果,與羅曉霞和劉正文研究的在同一個100mL試驗體系中以食物濃度范圍為0.25—20mgC•L–1【相當于0.0025—0.20mgC•(溞•d)–1】飼養10只對擬同形溞(Daphniasimiloides)得到的體長變化結果[24]是一致的。

4.2.2不同食物濃度對大型溞繁殖的影響幼溞的數量是反映親溞繁殖能力的主要指標[6–7]。在本研究中,0.01、0.05、0.10、0.15、0.20和0.30mgC•(溞•d)–1食物濃度組所產幼溞數量的平均值和標準差分別為3±3、68±10、118±16、164±15、205±22和231±20,統計學分析結果表明各食物濃度組所產幼溞數量的平均值之間均存在顯著性差異(P<0.05),表明食物濃度越高,大型溞生殖幼溞的數量就越多[8,10]。羅曉霞和劉正文的研究表明食物濃度過高或過低均不利于溞類的繁殖[24]。在本研究中,高食物濃度組中并未出現造成大型溞生殖幼溞的數量下降的情況,可能是設置的食物濃度還未足夠高;而當食物濃度低至0.01mgC•(溞•d)–1時,大型溞生殖幼溞的數量急劇下降,與Sims[8]的研究結果也相一致。

4.2.3大型溞繁殖試驗中食物濃度的選擇在本研究中,當食物濃度為0.05mgC•(溞•d)–1時,親溞生殖幼溞的數量的平均值為68只,就能滿足OECD、ISO和國內的大型溞繁殖試驗方法[6,22–23]對每只親溞所產存活幼溞的平均值≥60只的有效性要求,但是食物濃度低于其推薦的0.1—0.2mgC•(溞•d)–1范圍。因此,對于能吸附于藻細胞或被藻細胞降解的化學物質[11–16]的大型溞繁殖試驗測試,可調整食物濃度在0.05—0.1mgC•(溞•d)–1范圍,有利于受試物暴露濃度的維持。此外,在本研究中,0.20—0.30mgC•(溞•d)–1的食物濃度會使試驗溶液比較渾濁,但是并未發現對親溞的繁殖能力造成影響。但是,由于食物濃度達到0.2mgC•(溞•d)–1時,大型溞的體長增長就基本達到最大值,因此在大型溞繁殖試驗中也不建議采用高于0.2mgC•(溞•d)–1的食物濃度。

4.3國內本土大型溞品種的遺傳學信息采用分離自中國本土的大型溞品種作為試驗生物,嚴格按照OECD的大型溞繁殖試驗方法[6]的條件開展試驗,是完全能滿足試驗有效性的要求的。然而,OECD建議對大型溞的遺傳學信息進行鑒定[6]。國外已有不少研究鑒定了不同品系的大型溞的遺傳學信息存在差異[32],Baird等的研究也表明大型溞的遺傳學信息差異會影響大型溞對毒物的敏感性[32]。但是,國內對大型溞遺傳學的研究報道較少,因此,鑒定國內大型溞品種的遺傳學信息并與國外的相關研究數據相比較,可能可以獲得更多有意義的信息。

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作者：陳進林 梅承芳 高亮 梁笑婷 林振姍 曾國驅 許玫英 孫國萍 單位：廣東省微生物分析檢測中心 生態毒理與環境安全實驗室 廣東省微生物研究所 廣東省菌種保藏與應用重點實驗室 省部共建華南應用微生物國家重點實驗室