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《山東大學學報》2016年第一期

摘要：

目的探討風濕免疫性疾病患者潛伏結(jié)核感染（LTBI）狀況及影響結(jié)核感染T細胞斑點試驗（TS0POT．TB）結(jié)果的相關(guān)因素。方法選取2013年6月至2014年6月風濕免疫性疾病患者223例（病例組）和健康人群53例（健康對照組），抽取外周血，應用結(jié)核分枝桿菌特異性抗原ESAT6和CFP10刺激，對致敏T細胞應答反應進行檢測，并記錄糖皮質(zhì)激素和改善病情的抗風濕藥物（DMARDs）應用情況及LTBI高危因素。結(jié)果病例組TSPOT．TB陽性檢出率為20．18％，顯著高于健康對照組5．66％；病例組發(fā)生結(jié)核菌感染的相對風險（OR）是健康對照組的4．21倍（95％CI：1．21～14．70，P＜0．05）。病例組TSPOT．TB陽性檢出率和發(fā)生LTBI的風險存在明顯差異（P＜0．01），結(jié)節(jié)性紅斑患者組TSTPOT．TB陽性檢出率最高達44．0％，發(fā)生結(jié)核菌感染的風險是健康對照組的13．11倍（95％CI：3．44～49．98，P＜0．01）；類風濕關(guān)節(jié)炎患者陽性率為21．16％（OR值4．47，95％CI：1．06～18．82，P＜0．05）；其他風濕免疫性疾病TSTPOT．TB陽性檢出率10．0％～33．34％（OR值1．85～8．33，P＞0．05）。TSPOT．TB陽性和陰性應用糖皮質(zhì)激素和DMARDs治療患者所占比例差異均無統(tǒng)計學意義（P＞0．05）；既往TB感染史和CT檢查結(jié)果異常與TSPOT．TB陽性結(jié)果顯著相關(guān)（P＜0．01）。結(jié)論風濕免疫性疾病患者發(fā)生LTBI風險是健康對照組的4．21倍，TSPOT．TB試驗受激素及DMARDs藥物影響較小，是LTBI篩查的有效方法。

關(guān)鍵詞：

風濕免疫性疾病；潛伏結(jié)核感染；篩查；結(jié)核感染相對風險度；影響因素

風濕免疫性疾病是以皮膚、關(guān)節(jié)、血管及多系統(tǒng)損害為主或伴免疫功能異常的一類疾病。該病由于使用激素、免疫抑制劑，尤其是生物制劑治療等原因，成為結(jié)核菌感染的易感人群［16］，在接受腫瘤壞死因子（tumornecrosisfactor，TNF）拮抗劑治療期間，風濕免疫性疾病發(fā)生結(jié)核感染的風險是不用TNF拮抗劑治療患者的4倍，最高可達25倍，除活動性肺結(jié)核外，很多患者表現(xiàn)為痰菌陰性、無癥狀的潛伏結(jié)核感染（latenttuberculosisinfection，LTBI）［24］。因此，在接受生物制劑治療前對風濕免疫性疾病患者進行有效的LTBI篩查，并進行預防性抗結(jié)核治療尤為重要。傳統(tǒng)的結(jié)核感染篩查方法是結(jié)核菌素皮膚試驗（tuberculinskintest，TST），該方法因卡介苗（bacilluscalmetteguerin，BCG）接種和免疫抑制劑應用等因素的影響，易出現(xiàn)假陽性和假陰性，造成臨床對結(jié)核病的漏診和誤診［26］。結(jié)核感染T細胞酶聯(lián)免疫斑點試驗（Tcellbasedenzymelinkedimmunospotassay，TSPOT．TB）主要是用結(jié)核分枝桿菌兩個特異性抗原ESAT6和CFP10刺激外周血T淋巴細胞，通過檢測致敏淋巴細胞數(shù)量來診斷結(jié)核菌感染的技術(shù)，為LTBI的早期發(fā)現(xiàn)提供了新的診斷方法，其靈敏度和特異性均高于TST法［68］，國外有研究應用TSPOT．TB檢測替代TST試驗用于風濕病患者LTBI的篩查［4］，而國內(nèi)有關(guān)研究較少。本研究通過探討風濕免疫性疾病患者LIBI發(fā)生率和發(fā)生結(jié)核感染的相對風險度（oddsratio，OR），為結(jié)核病的早期預防和治療提供依據(jù)，以降低結(jié)核病的發(fā)生和傳播。

1資料與方法

1．1臨床資料

1．1．1研究對象選取2013年6月至2014年6月在濰坊市人民醫(yī)院風濕免疫科門診和住院的風濕免疫性疾病患者223例（病例組），其中男85例，女138例，11～83歲，平均（44．0±7．8）歲；同時選取我院查體中心健康人群53例（健康對照組），其中男20例，女33例，9～59歲，平均（39．0±5．4）歲。病例組符合相應的風濕免疫性疾病診斷標準，均未發(fā)現(xiàn)活動性結(jié)核，部分患者擬接受生物制劑治療；病例組登記卡介苗（BCG）接種史、發(fā)病史、治療藥物、LTBI高危因素（包括結(jié)核病史及家族史、近期結(jié)核病接觸史、胸部CT檢查結(jié)果為結(jié)節(jié)、片狀陰影、鈣化灶、肺炎、積液、脊柱或骶髂CT檢查為關(guān)節(jié)炎性改變）等相關(guān)信息。健康對照組均經(jīng)胸部X線、生化及免疫學等檢查結(jié)果證實無異常，無結(jié)核（tuberculosis，TB）病史、家族TB感染史、近期結(jié)核患者密切接觸史等。兩組均無人類免疫缺陷病毒（humanimmunodeficiencyvirus，HIV）感染和嚴重的肝腎功能損傷。

1．1．2主要試劑與儀器X15R臺式離心機（美國，貝克曼公司），HF90CO2培養(yǎng)箱（上海力康醫(yī)療設(shè)備有限公司），BX2顯微鏡（日本，Olympus）；TSPOT．TB試劑盒（英國OxfordImmunotec生產(chǎn)，上海復星長征醫(yī)學科學有限公司提供）：

1．2方法

1．2．1標本采集采集靜脈血5mL于肝素抗凝的真空管內(nèi)，充分混勻，4h內(nèi)送檢。血常規(guī)白細胞＜3．0×109／L和／或淋巴細胞絕對值＜0．85×109／L抽取10mL肝素抗凝血送檢。

1．2．2外周血單個核細胞分離5mL肝素放凝血加等量RPMI1640培養(yǎng)基混勻后，疊加于盛有4mL淋巴細胞分離液的無菌離心管中，2000r／min離心20min，吸取PBMCs細胞層，RPMI1640培養(yǎng)基洗滌2次，加0．5mLAMIV培養(yǎng)基懸浮細胞并計數(shù)，根據(jù)計數(shù)細胞數(shù)量，用AMIV培養(yǎng)基配制2．5×105／mLPBMCs的細胞懸液。

1．2．3采用酶聯(lián)免疫斑點法檢測致敏淋巴細胞數(shù)量按說明書操作，每份標本設(shè)陰性對照孔，A、B檢測孔和陽性對照孔，分別加入AMIV培養(yǎng)基、A抗原（ESAT6）、B抗原（CFP10）和PHA各50μL，每孔加稀釋好的PBMCs細胞懸液各100μL，置37℃、5％CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)16～20h，PBS沖洗4次；每孔加稀釋好的酶標記抗體50μL，2℃～8℃孵育1h；PBS沖洗4次，加入底物，暗處顯色7min，蒸餾水終止反應；37℃干燥15～20min，顯微鏡下計數(shù)斑點數(shù)。陽性判斷標準：①陰性對照孔斑點數(shù)為0～5個：A或B檢測孔斑點數(shù)減去陰性對照孔斑點數(shù)≥6個為陽性；②陰性對照孔斑點數(shù)為6～10個：A或B檢測孔斑點數(shù)≥2倍陰性對照孔斑點數(shù)為陽性；同時陽性對照孔斑點數(shù)必須≥20個。

1．3統(tǒng)計學處理采用SPSS13．0統(tǒng)計學軟件，率的比較采用χ2檢驗，計量資料以x珋±s表示，兩者間計量資料采用t檢驗，相對風險度以比數(shù)比（Oddsratio，OR）表示，OR值95％可信區(qū)間（Confidenceinterval，CI）采用Miettinen法計算。P＜0．05為差異有統(tǒng)計學意義。

2結(jié)果

2．1兩組臨床資料比較病例組類風濕關(guān)節(jié)炎52例（23．32％）、強直性脊柱炎32例（14．35％）、系統(tǒng)性紅斑狼瘡29例（13．01％）、結(jié)節(jié)性紅斑25例（12．21％）、系統(tǒng)性血管炎24例（10．77％）、結(jié)締組織病16例（7．18％）、白塞氏綜合癥10例（4．49％）、成人斯蒂爾病8例（3．59％）、干燥綜合征7例（3．14％）、未分化脊柱關(guān)節(jié)炎7例（3．14％）、銀屑病關(guān)節(jié)炎7例（3．14％）、風濕性多肌痛6例（2．69）。84例（37．67％）患者服用小劑量類固醇激素治療，99例（44．40％）患者接受DMARDs藥物治療。121例（54．26％）患者存在LTBI高危因素，其中有TB感染史14例（6．28％）、胸部或脊柱及骶髂等部位CT檢查結(jié)果異常（主要為肺部結(jié)節(jié)、片狀陰影、鈣化灶、肺炎、積液、脊柱或骶髂關(guān)節(jié)炎性改變等）99例（44．40％）、近期TB患者接觸史2例（0．90％）、家族TB感染史6例（2．69％）。218例（97．76％）患者接種BCG，健康對照組均接種過BCG。

2．2兩組TSPOT．TB檢測結(jié)果病例組TSPOT．TB陽性檢出率（20．18％）顯著高于健康對照組（5．66％），病例組發(fā)生結(jié)核菌感染的風險是健康對照組的4．21倍（95％CI：1．21～14．70，P＜0．05）。病例組結(jié)節(jié)性紅斑患者TSPOT．TB陽性檢出率達44．0％，發(fā)生結(jié)核菌感染的風險是健康對照組的13．11倍（95％CI：3．44～49．98，P＜0．01）；25例結(jié)節(jié)性紅斑患者均為繼發(fā)性，其中11例TSPOT．TB陽性結(jié)節(jié)性紅斑患者進行了皮下結(jié)節(jié)活檢，8例炎細胞浸潤，干酪樣壞死以及上皮樣細胞和單核細胞組成的結(jié)核樣浸潤，診斷為結(jié)核性結(jié)節(jié)性紅斑；3例皮下組織間隔性脂膜炎，淋巴細胞和巨噬細胞浸潤，未見干酪樣壞死和肉芽腫病變。14例TSPOT．TB陰性結(jié)節(jié)性紅斑患者拒絕活檢。類風濕關(guān)節(jié)炎陽性檢出率21．16％（OR＝4．47，95％CI：1．06～18．82，P＜0．05）；風濕性多肌痛和強直性脊柱炎等其他風濕免疫性疾病患者，雖然TSPOT．TB陽性檢出率均高于對照組，但差異均無統(tǒng)計學意義（P＞0．05）。見表1。

2．3病例組TSPOT．TB檢測結(jié)果與相關(guān)因素分析TSPOT．TB陽性和陰性患者，應用糖皮質(zhì)激素和DMARDs治療及LTBI高危因素所占比例比較差異無統(tǒng)計學意義（P＞0．05），見表2。LTBI高危因素分析顯示，9例TSPOT．TB陽性患者（20．0％）具有TB感染史，顯著高于陰性患者5例（2．81％）（χ2＝18．04，P＜0．01）；45例TSPOT．TB陽性患者中28例（62．22％）胸部、脊柱及骶髂CT檢查結(jié)果疑似結(jié)核，而178例TSPOT．TB陰性患者中71例（39．89％）CT檢查結(jié)果疑似結(jié)核，兩者比較差異有統(tǒng)計學意義（χ2＝7．26，P＜0．01）；具有TB家族史患者TSPOT．TB陽性和陰性分別為1例（2．22％）和5例（2．81％），差異無統(tǒng)計學意義（P＞0．05）。14例TB感染史患者肺部CI結(jié)果提示：肺部結(jié)節(jié)或陳舊性結(jié)核病灶8例，病史均在6年以上。99例應用DMARDs治療的患者，其中17例應用甲氨蝶呤（MTX），74例應用羥氯喹，8例MTX和羥氯喹聯(lián)合應用，TSPOT．TB陽性檢出率分別為29．42％、25．43％和14．29％，差異無統(tǒng)計學意義（χ2＝1．089，P＞0．05）。

3討論

結(jié)核病是一個全球性的公共健康問題，也是我國重點控制的疾病之一。較多研究重點放在活動性結(jié)核的治療上，缺乏對LTBI的診斷和預防性措施的深入研究。除活動性結(jié)核外，眾多患者表現(xiàn)為痰菌陰性的LTBI，極易被漏診、誤診，進而發(fā)展成為活動性結(jié)核導致結(jié)核病的傳播和蔓延，到目前為止尚缺乏有效的LTBI診斷方法。傳統(tǒng)篩查結(jié)核感染的TST試驗，其結(jié)果受多種因素影響，接種BCG、環(huán)境中的非結(jié)核分枝桿菌感染、重復試驗的加強反應等均可導致假陽性結(jié)果，使用免疫抑制劑治療的風濕免疫病、營養(yǎng)不良、體質(zhì)較弱、感染結(jié)核14d內(nèi)的患者，TST試驗均可出現(xiàn)假陰性［36］。近年IGRAs作為結(jié)核感染診斷方法，已逐步被臨床接受。TSPOT．TB試驗通過測定分泌IFNγ的T細胞數(shù)量來診斷結(jié)核感染，所用的刺激抗原為ESAT6和CFP10，不受BCG接種和大多數(shù)NTM影響，因而其靈敏度和特異性較高。2013年美國CDC推薦IGRAs替代TST作為LTBI的篩查方法［7］，2006年瑞士在制定的“抗TNFα治療前結(jié)核感染篩查指南”中肯定了IGRAs試驗的作用，一致認為如IGRAs結(jié)果為陽性，患者有可能為LTBI，建議進行預防性治療（異煙肼或者利福平）［4］。

結(jié)核分支桿菌感染是抗TNF治療的一種嚴重并發(fā)癥，加強高危人群的篩查和預防性抗癆治療，可有效減少抗TNF制劑導致的結(jié)核感染風險。TSPOT．TB試驗檢測結(jié)果不受強的松龍（prednisolone，PSL）的影響，特異性顯著高于TST方法，TSPOT（）／PPD（＋＋）的RA患者在未接受預防抗?jié)持委熛掳从媱澖邮苌镏苿┲委煟S訪過程中未發(fā)生活動性結(jié)核，認為該試驗是風濕病患者LTBI篩查的有效方法［910］。Xie等［11］研究認為，在結(jié)核發(fā)病率和BCG接種率較高的中國，TSPOT．TB試驗在診斷風濕病患者LTBI中比TST具有更高的特異性。目前多數(shù)研究針對TST與TSPOT．TB檢測結(jié)果進行比較，尚缺乏對風濕免疫性疾病不同病種患者結(jié)核感染易感性的研究報道。本研究結(jié)果表明，風濕免疫性疾病患者發(fā)生結(jié)核菌感染的風險是健康對照組的4．21倍，不同風濕免疫性疾病患者發(fā)生結(jié)核感染的風險存在明顯差異，TSTPOT．TB陽性檢出率和OR值由高到低分別為：結(jié)節(jié)性紅斑、風濕性多肌痛、類風濕關(guān)節(jié)炎、強直性脊柱炎、系統(tǒng)性血管炎、干燥綜合征、未分化脊柱關(guān)節(jié)炎、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、結(jié)締組織病、成人斯蒂爾病、白塞氏綜合征，繼發(fā)性結(jié)節(jié)性紅斑與結(jié)核桿菌感染密切相關(guān)，既往TB感染史和胸部、脊柱及骶髂CT檢查結(jié)果異常與TSPOT．TB檢測結(jié)果顯著相關(guān)；糖皮質(zhì)激素和DMARDs治療對TSPOT．TB試驗結(jié)果影響較小，故TSPOT．TB試驗更適合免疫低下、接受免疫抑制劑治療患者LTBI的檢測。

綜上所述，TSPOT．TB試驗具有較高的敏感性和特異性，雖然假陰性、不確定影響因素（如Treg）和不確定結(jié)果也存在，但是其發(fā)生率遠低于TST試驗。我國是BCG接種率較高的國家，風濕病人群中TST陽性／TSPOT．TB陰性的比例高達26％，應用TSPOT．TB檢測可減少不必要的預防用藥給患者帶來的傷害。本研究報道了不同風濕免疫性疾病患者TSPOT．TB陽性檢出率，以及相對健康對照組可能發(fā)生LTBI的OR值，對指導臨床早期預防和治療LTBI患者，避免結(jié)核病的傳播具有重要意義。

作者：蓋林林 管立學 李海波 褚錦錦 朱蕓 李明 單位：濰坊醫(yī)學院臨床檢驗診斷學教研室 濰坊市人民醫(yī)院中心實驗室 濰坊市人民醫(yī)院風濕免疫科