本站小編為你精心準備了人結腸癌細胞惡性表型的影響參考范文，愿這些范文能點燃您思維的火花，激發(fā)您的寫作靈感。歡迎深入閱讀并收藏。

《醫(yī)學研究生學報》2014年第六期

1材料與方法

1．1細胞轉染體系建立及實驗分組HT-29和HCT-116細胞株轉染方法按Lipofectamine2000產品說明書進行。轉染前1d將細胞分別以1×105個/孔、5×104個/孔的密度接種于24孔板中，使轉染前細胞融合率達到60%～70%。轉染時設定脂質體的濃度分別為0．5、1、1．5μL，并將其稀釋于RPMI1640或DMEM培養(yǎng)基50μL，pGPH-shFoxM1及其陰性對照pGPH-shNC的濃度分別為:0．5、1、2、4μg，稀釋后脂質體靜置5min，與同樣用培養(yǎng)基50μL稀釋的質粒混合，靜置20min，分別加入24孔板中。轉染6h后更換新鮮培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)，48～72h后熒光顯微鏡觀察轉染效率。HCT-116、HT-292種細胞株均分為3組，具體如下述:①空白對照組(不轉染組);②實驗對照組:轉染相應空載質粒(pGPH-shNC及pEX-2-NC);③實驗組:轉染FoxM1干擾質粒及FoxM1過表達質粒。

1．2熒光實時定量(realtimePCR，RT-PCR)法檢測FoxM1基因表達水平取各組轉染后24h細胞，采用Trizol提取總RNA，經Dnase酶消化基因組DNA后，采用TAKARA公司的反轉錄試劑盒(Prime-Script1stStrandcDNASynthesisKit)進行cDNA的反轉錄，方法參照試劑盒說明書。同時采用TAKARA公司的定量試劑盒(SYBRPremixExTaq)進行RT-PCR檢測，反應體系參考試劑盒說明書。PCR反應條件為95℃，10s;60℃，10s;72℃，10s;共40個循環(huán)。讀取CT值，采用△△CT法進行數據分析。FoxM1的定量引物為:正義鏈:5''''-AACCGCTACT-TGACATTGG-3''''，反義鏈:5''''-GCAGTGGCTTCATCTTCC-3''''。GAPDH的定量引物為:正義鏈:5''''-TGTTGCCAT-CAATGACCCCTT-3''''，反義鏈:5''''-CTCCACGACGTACT-CAGCG-3''''。

1．3Westernblot方法檢測FoxM1蛋白表達水平提取轉染72h后各組細胞的總蛋白，并進行蛋白定量，按《分子克隆實驗指南》［11］所述方法配制SDS-PAGE分離膠(12%)和濃縮膠(5%)，待膠凝固后每孔上樣30μg蛋白，常規(guī)電泳、轉PVDF膜、顯像。利用圖像分析儀對膠片顯像條帶進行灰度分析，以內參照β-actin進行校正。

1．4劃痕愈合試驗取對數生長期穩(wěn)定的轉染細胞，細胞接種于包被CollagenⅣ的6孔板，置37℃細胞培養(yǎng)箱中孵育過夜后回收CollagenⅣ，再將培養(yǎng)板在培養(yǎng)箱中干燥過夜，培養(yǎng)至細胞呈現出單層貼壁生長狀態(tài)。分別在各組單細胞層上劃痕，用含10%FBS的培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)以使劃痕愈合。分別于劃痕后0、12、24、48h每個孔取4個視野拍照，在倒置顯微鏡下觀察劃痕愈合能力，用愈合率代表愈合能力。

1．5Transwell侵襲試驗取對數生長期穩(wěn)定轉染細胞，用無血清RPMll640培養(yǎng)過夜。通過24孔趨化小室和matrigel膠檢測細胞侵襲性。結果表示為穿過matrigel膠和聚碳酸酯膜的細胞數，顯微鏡下每個復孔取5個高倍鏡視野計數(×400)，計算平均值。

1．6統計學分析采用SPSS17．0軟件進行統計分析。定量結果以均數±標準差(x±s)表示，兩組間均值比較采用t檢驗，多組之間均數比較采用單因素方差分析(ANOVA)。以P≤0．05為差異有統計學意義。

2結果

2．12株人腸癌細胞系的FoxM1表達分析RT-PCR及Westernblot檢測均顯示，FoxM1在HT-29細胞中表達水平較HCT-116高。見圖1。

2．2HT-29和HCT-116轉染體系的建立采用pGPH-shNC(FAM)空載體轉染HT-29和HCT-116細胞48h后檢測熒光信號，根據熒光強度檢測轉染效率，從而建立高效的HT-29和HCT-116轉染體系。結果表明，脂質體為1μL/孔，pGPH-shNC(FAM)濃度2μg/孔時，共培養(yǎng)48h為最佳的轉染條件。見圖2。

2．3FoxM1基因對HT-29和HCT-116侵襲性的影響為研究FoxM1的表達對人結腸癌細胞的調控，本研究基于優(yōu)化的HT-29和HCT-116轉染體系，應用RNA干擾技術有效下調FoxM1在HT-29細胞中的表達，同時采用過表達質粒調高HCT-116中FoxM1表達水平，24h后提取RNA，72h后提取蛋白。RT-PCR檢測結果表明HCT-116細胞株中過表達FoxM1后其mRNA的表達水平顯著上調，采用pGPH-shFoxM1轉染HT-29細胞后，FoxM1表達水平顯著下調。Westernblot結果亦表明，FoxM1蛋白在HT-29中成功下調，在HCT-116中成功上調。見圖3。

2．3．1劃痕愈合實驗轉染pGPH-shFoxM148h后，HT-29的增殖能力明顯受到抑制，愈合率僅為(10．37±3．86)%，與HT-29實驗對照組(42．0±2．0)%及HT-29空白對照組(37．0±2．2)%相比差異具有統計學意義(P＜0．05)。而在HCT-116細胞中上調表達FOXM1后，愈合率提高至(70．92±1．48)%，表示增殖力明顯得到了提高，與HCT-116實驗對照組［(18．43±3．01)%］及HCT-116空白對照組［(67．36±2．61)%］相比差異具有統計學意義(P＜0．05)。見圖4。

2．3．2Tanswell小室檢測細胞侵襲能力HT-29和HCT-116腸癌細胞接種在Matrigel膠鋪被的transwell小室中48h之后，HCT-116實驗組平均穿膜細胞數［(186．0±6．8)個］較HCT-116實驗對照組［(42．0±2．0)個］和HCT-116空白對照組［(37．0±2．2)個］升高，差異有統計學意義(P＜0．05);HT-29實驗組平均穿膜細胞數［(53．0±1．8)個］較HT-29空白對照組［(118．0±4．0)個］和HT-29實驗對照組［(95．0±2．2)個］降低，差異有統計學意義(P＜0．05)。見圖5。

3討論

FoxM1參與細胞增殖、凋亡以及人體多種器官發(fā)育［4］。FoxM1僅表達于高增殖狀態(tài)的細胞中，如所有胚胎組織，特別是上皮和間質的增殖細胞中;在人體組織中，FoxM1僅高度表達于胸腺和睪丸組織，中度表達于肺和腸道［12］。惡性腫瘤的發(fā)生正是由于在致癌因素作用下，遺傳物質發(fā)生改變導致細胞增殖信號過度活化。研究發(fā)現，FoxM1常高表達于肝癌［13］、前列腺癌、胃癌［15］等多種惡性腫瘤中，同時，它與多種癌基因信號轉導途徑相關［16］，包括表皮生長因子受體(epidermalgrowthfactorreceptor，EGFR)信號通路、磷酸肌醇3激酶/蛋白激酶B(phosphoinositide3kinese/proteinkinaseB，PI3K/Akt)信號通路、核轉錄因子κB(nuclearfactor-kappaB，NF-κB)信號通路、絲裂原活化蛋白激酶(mitogenactivatedproteinkinase，MAPK)信號通路、細胞外信號激酶(extracellularsig-nal-regulatedkinase，ERK)信號通路、蛋白酶體通路等。特異性FoxM1抑制劑在腫瘤治療方面的研究提示FoxM1極有希望成為一個新的抗癌靶點。在肝細胞癌(hepaticcellulercancer，HCC)中，FoxM1是ERK的主要效應器。FoxM1b在HCC小鼠模型及HCC細胞系中，均有高表達。其表達增高與ERK正相關，可促進HCC的腫瘤血管生成，抑制腫瘤細胞凋亡。相反，抑制FoxM1b表達，可下調ERK激活水平，減少HCC細胞株的血管形成，促進細胞凋亡。FoxM1c可增強細胞增殖的關鍵因子cyclinE/Cdk2的表達，后者被認為是c-myc基因的反式激活啟動子［4］。有學者在胃癌細胞株研究中發(fā)現，c-myc是FoxM1調控的下游基因。國內外研究發(fā)現，FoxM1和NF-κB在細胞分化、細胞周期、細胞增殖、細胞死亡、細胞遷移等生物學行為中發(fā)揮重要作用，但兩者之間的相互作用機制仍需進一步闡明。Ma等發(fā)現，Raf/MEK/MAPK的激活對于FoxM1核轉移不可或缺，同時，可促進FoxM1與cyclinB1之間交互作用，繼而促進細胞的有絲分裂。應用Raf/MEK/MAPK抑制劑U0126后，FoxM1表達顯著受抑，并使細胞停滯于G2/M期。綜上所述，FoxM1表達失調與多種細胞增殖、凋亡等進程相關細胞因子及信號轉導通路均相關，已成為研究腫瘤發(fā)生、發(fā)展過程中的新熱點分子。

本研究在細胞水平探索了FoxM1表達水平變化對結腸癌細胞的體外運動和侵襲性。首先針對FoxM1基因設計了3條不同的siRNA干涉序列，優(yōu)化siRNA轉染條件后應用不同的siRNA對細胞進行轉染，最終選定抑制效果最強的FoxM1siRNA。繼而根據該序列合成干擾表達質粒pGPH-shFoxM1。應用RT-PCR及Westernblot檢測，提示FoxM1在HT-29細胞中高表達，而在HCT-116細胞中呈低表達。進一步在細胞水平探索了FoxM1表達對結腸癌細胞的體外運動和侵襲性的影響。采用RNA干擾的方法下調結腸癌細胞HT-29中FoxM1表達水平并采用過表達質粒調高HCT-116中FoxM1表達，利用劃痕實驗和細胞侵襲實驗探討FoxM1對結腸癌細胞生長和侵襲能力的影響。結果顯示RNA干擾可使FoxM1表達下調，下調FoxM1表達可抑制細胞的遷移能力和侵襲性。反之，過表達質粒可有效調高FoxM1表達水平，上調FoxM1表達可提高細胞的遷移能力和侵襲性。本研究與Kalinichenko等研究結果相似，抑制FoxM1表達可顯著抑制肝癌等多種細胞的遷移能力和增殖性。這些結果均為尋找新的治療靶點提供了有力的依據。總之，FoxM1對結腸癌細胞增殖和侵襲能力具有重要的影響，具有發(fā)展成新型結腸癌治療靶位的潛力。

作者：冒曉蓓劉小北徐凱褚曉源郁紅菊薛利軍陳亞楠任麗麗戴婷婷陳龍邦單位：第二軍醫(yī)大學南京臨床醫(yī)學院