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《醫學研究生學報》2014年第六期

1資料與方法

1．1實驗方法

1．1．1主要試劑及儀器蛋白酶K(北京艾比根生物技術有限公司);Tris．Base(上海拜沃生物科技有限公司);WizardDNAClean-UpSystem(Promega公司);Tap酶(Invitrogen，USA);甲基化轉移酶(M．SssI)(NEB公司，美國);引物、三氯甲烷、飽和酚、乙二胺四乙酸、十二烷基磺酸鈉、無水乙醇(大連寶生生物公司)。恒溫水浴箱(SHELLAB公司，美國);高速離心機(Eppendorf公司);GeneAmp9700型PCR擴增儀(ABI公司，美國);凝膠自動成像儀(TOCAN320型);電泳儀(伯樂公司，美國)。

1．1．2DNA提取采用標準蛋白酶K消化法進行DNA提取，在提取之前，組織標本經HE染色證實腫瘤細胞的存在，并選擇惡性腫瘤細胞≥75%的區域的組織提取DNA。

1．1．3亞硫酸氫鈉修飾參照《分子克隆實驗指南》進行操作［6］:先將約2μgDNA在1．5mLEP管中，用雙蒸水稀釋至50μL，加5．5μL新鮮配制的3molNaOH后42℃水浴30min，然后加30μL10mmol/L對苯二酚至上述水浴后的混合液中;再加入520μL3．6mol亞硫酸氫鈉(配制:1．88g亞硫酸氫鈉使用DDW稀釋，并以3mol/LNaOH滴定溶液至PH5．0，最終體積為5mL)。EP管外裹以鋁箔紙，避光，輕柔顛倒混勻溶液，加200μL石蠟油，50℃避光水浴16h。

1．1．4修飾后的DNA純化回收預熱樹脂10min(37℃)，將移液器槍頭伸入石蠟油層下吸取混合液600μL至一潔凈2mLEP管中;然后使用PromegawizardCleanupDNA純化回收系統，對修飾后的DNA進行純化回收。

1．1．5甲基化特異性PCR反應PCR反應體系:去離子水11．65μL;10×buffer2μL;dNTP1．6μL;上、下游引物各1μL;DNA模板3μL;Tap酶0．15μL;加去離子水至20μL。循環參數:94℃預變性5min后35個循環:94℃變性30s，54℃復性30s，72℃延伸30s，最后1個循環延伸5min。將產物瓊脂糖凝膠(2．5g/L)電泳，GeneFinder染料染色。以甲基化酶處理正常人外周血細胞、去離子水分別作為甲基化陽性對照、甲基化陰性對照及空白對照。每批標本同時擴增甲基化和非甲基化陽性對照。甲基化上游引物:5''''-GTTAGTTTTTTTTTTTATTT-TAGTGGTTCGA-3''''，下游引物:5''''-TCCAAAACCTC-CCGAAAACGAAAACG-3'''';非甲基化上游引物:5''''-GGT-TAGTTTTTTTTTTTATTTTAGTGGTTTGA-3''''，下游引物:5''''-ATTTCCAAAACCTCCCAAAAACAAAAACA-3''''。

1．2統計學分析所有數據均采用SPSS20．0軟件進行處理，RECK基因啟動子區甲基化狀況與臨床病理參數的關系采用χ2檢驗，必要時采用Fisher確切概率法。對完成至少5年隨訪的患者行生存分析。生存曲線采用Kaplan-Meier法估計，并采用Log-rank檢驗分析不同組別的差異。危險因素與患者總體生存率的關系采用多因素COX比例風險模型分析，以P≤0．05為有統計學意義。

2結果

2．1臨床及病理學特征70例患者中，共有37例(52．86%)發生RECK基因甲基化，經χ2檢驗，RECK基因甲基化在不同年齡、性別，吸煙、飲酒、淋巴結轉移與否，TNM分期間差異無統計學意義(P＞0．05);腫瘤組織中等及高分化的患者的RECK基因甲基化率遠遠高于分化程度較低的患者。15名正常人喉黏膜組織均未發現甲基化。見表1。

2．2喉鱗狀細胞癌及正常組織的甲基化情況37例(52．86%)原發喉鱗狀細胞癌標本發生甲基化，見圖1。29對喉鱗狀細胞癌-癌旁組織匹配的標本中，喉鱗狀細胞癌組織發生RECK基因甲基化16例(55．12%)，癌旁組織發生RECK基因甲基化8例(27．59%)，經配對四格表資料的精確概率檢驗，2組的甲基化率比較差異有統計學意義(P=0．029)。見表2。

2．3RECK基因啟動子區甲基化與患者的生存預后的關系本組70例患者中，64例完成了5年隨訪，中位無瘤生存期為41個月，中位總體生存期為52個月。本研究只針對完成5年隨訪的64例患者分析RECK基因啟動子區甲基化與生存預后的關系。經Log-rank分析，RECK基因甲基化可明顯縮短患者的無瘤生存期和總體生存期(P=0．017，P=0．024)，見圖2。此外，有淋巴結轉移、Ⅲ-Ⅳ級臨床分期、腫瘤組織中等及高分化與患者較差的預后有關，有淋巴結轉移、Ⅲ-Ⅳ級臨床分期可明顯縮短患者的無瘤生存期和總體生存期。腫瘤組織中等及高分化可縮短患者的無瘤生存期。見表3。行多因素COX回歸(ENTER)分析，無瘤生存期及總體生存期的COX回歸方程擬合效果均較好(χ2=12．374，P＜0．001;χ2=24．123，P=0．001)，結果顯示:RECK基因甲基化是患者無瘤生存期的獨立危險因素;總體生存期的獨立危險因素為:有無淋巴結轉移、臨床分期、RECK基因甲基化，提示:RECK基因甲基化與喉鱗狀細胞癌患者的生存期具有重要的關系。見表3、表4。

3討論

RECK基因啟動子區的甲基化與許多惡性腫瘤的轉移和浸潤有關。本研究結果顯示:RECK基因甲基化不僅在喉鱗狀細胞癌組織中發生，而且在喉鱗狀細胞癌旁正常組織中也會發生，并且在15名健康者正常組織中均未見RECK基因甲基化，說明抑癌基因甲基化可作為惡性腫瘤早期發生的生物學標志。本研究實驗結果還發現29對喉鱗狀細胞癌組織-癌旁組織匹配的標本中，有3例僅在癌旁組織中發生了甲基化，而相對應的喉鱗狀細胞癌組織中未發現RECK甲基化，提示病理學正常的組織發生RECK基因甲基化可能預示著惡性腫瘤附近的組織具有一個范圍較大的潛在的甲基化區域，在肝癌、前列腺癌等惡性腫瘤中也發現了類似的規律，因此，抑癌基因啟動子區甲基化可看做是惡性腫瘤的一類癌前病變［7］。RECK基因一種新型抑癌基因，定位于9P13-9P12，通過抑制基質金屬蛋白酶(matrixmetallopepti-dase，MMP)而實現抑制腫瘤細胞再生、浸潤和轉移的作用［8－9］。有實驗結果表明:在惡性腫瘤組織中，MMP2、MMP9均呈高表達，特別是MMP2的陽性表達與腫瘤分期、淋巴結狀態等病理特征具有重要關系［10－11］。有研究提示，RECK基因高表達的腫瘤患者的生存預后明顯優于RECK基因低表達者［12］。

這與本實驗結果綜合提示:喉鱗狀細胞癌RECK基因由于甲基化而滅活，從而使患者的生存預后更差［11，13］。因此，去甲基化可應用于抗腫瘤的治療過程中，可為改善包括喉鱗狀細胞癌在內的惡性腫瘤患者的治療帶來新希望［15］。以往有研究表明:吸煙、飲酒是影響惡性腫瘤患者生存的危險因素，這一規律也得到了很多學者的認同［16］。但本研究發現吸煙、飲酒與患者的生存率關聯不大，但這并不意味著吸煙、飲酒不是喉鱗狀細胞癌患者生存率的影響因素。喉癌的早期癥狀為聲音嘶啞、有異物感、痰多、咽部不適等，這些癥狀的存在，可能會使患者減少吸煙、飲酒，從而減弱了其與喉鱗狀細胞癌的真實關聯。因此，吸煙、飲酒仍然是影響喉鱗狀細胞癌患者生存的潛在危險因素，并具有重要的公共衛生學意義。本研究重點分析了RECK基因啟動子甲基化狀況與預后的關系。結果表明:甲基化的RECK基因檢測是預測患者較差預后的新途徑，越來越多的研究結果支持這一觀點［12－13］。RECK基因啟動子區甲基化是人喉鱗狀細胞癌的早期事件，在癌旁正常組織中也可發生，并且與患者較差的預后有重要關聯。RECK基因啟動子區甲基化可作為一個重要的早期發現并預測患者預后的早期生物標志物。

作者：崔靜李輝田艷勛單位：邢臺市人民醫院耳鼻咽喉科