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《中國抗生素雜志》2016年第二期

摘要：

目的優化魚體內喹乙醇及代謝物的檢測技術，探明獸藥抗菌劑喹乙醇的生物富集特性。方法選擇斑馬魚作為受試生物，通過檢出效率試驗確定了斑馬魚體內喹乙醇及代謝物MQCA的檢測方法；采用半靜態試驗測定了2個暴露水平下喹乙醇的生物富集特性。結果乙腈超聲提取-柱層析凈化-高效液相色譜/質譜聯用測定法(HPLC/MS)可同步檢出斑馬魚體內喹乙醇及代謝標志物MQCA的含量；斑馬魚體內喹乙醇在的最大富集量分別出現在第4天(暴露濃度0.25mg/L)和第6天(暴露濃度1mg/L)，生物富集系數為0.18~0.30，實驗期內代謝物MQCA的最大殘留濃度為0.013~0.016mg/kg，出現在第2天(喹乙醇暴露濃度1mg/L)和第4天(喹乙醇暴露濃度0.25mg/L)。結論本文建立的喹乙醇及其代謝物的檢測技術準確可靠，單一水溶液暴露方式下斑馬魚對喹乙醇的富集性較低，本研究為該類藥物的慢性毒性評價提供了基礎數據支撐。

關鍵詞：

喹乙醇；MQCA；檢測方法；生物富集

喹乙醇(olaquindox，簡稱OLA)又名喹酰胺醇，為純化學合成類廣譜抗菌藥，對魚類的致病菌革蘭陰性菌、衣原體、螺旋體及放線菌等均具有良好的抑制和殺滅作用[1-2]。同時也被廣泛用作水產養殖及畜禽養殖的飼料添加劑[3-4]。近年的生態毒理學研究表明，長期大劑量的使用OLA會導致生殖魚類中毒，抗應激能力低下，出現“應激性出血”并發生大量突發性死亡，給養殖業造成較大損失[5-6]；又因OLA具有致突變、致癌和生殖毒性等危害，在美國和歐盟禁止將其用作飼料添加劑，在國內OLA被禁止用于家禽及水產養殖。3-甲基-喹噁林-2羧酸(MQCA)是OLA的主要代謝物，其在魚體內相對穩定，是國際食品法典委員會認定的殘留標識物[7]。由于OLA廣泛應用帶來的影響和危害較大，因此，開展OLA及MQCA的環境檢測研究尤為重要。然而關于OLA及其代謝物MQCA的同步檢出研究的未見報道；同時，目前關于魚體內OLA的蓄積研究多采用餌料投喂及肌肉注射(腹腔注射)的方式進行，其生物富集特性的研究未見明確報道。為探明OLA在標志性水生生物-斑馬魚體內的生物富集特性，本實驗采用水溶液暴露的研究方式，首先研究了斑馬魚體內OLA和MQCA的同步檢出技術，后參照《化學農藥環境安全評價試驗準則第7部分：生物富集試驗》[8]進行8d的生物富集試驗，以期為OLA的慢性毒性測試及病理學測試提供參考。

1儀器與試劑

1.1實驗材料實驗用斑馬魚(Brachydaniorerio)取自中國科學院水生生物研究所，實驗開始時魚體長(連尾)2~3cm，體重約0.10~0.20g/尾，每一試驗濃度的試驗魚50尾。試驗前在室內馴養一周，預養期間斑馬魚生長正常，無死亡。OLA(純度99%)、MQCA(純度95%)，均由德國Dr.Ehrenstorfer生產；實驗用甲醇、乙腈，正己烷均為色譜純，德國Merck試劑公司生產；無水硫酸鈉，硫酸鋅，中性氧化鋁均為分析純，國藥集團上海試劑廠生產。

1.2實驗儀器Waters超高效液相色譜-串聯質譜儀(HPLC-MS，AcquityQuattroMicro)，工作站Mslynx4.1，美國Waters公司制造；超聲波提取器，KQ-50DA，昆山市超聲儀器有限公司制造；旋轉蒸發儀，N-1001，日本EYELA制造；超純水儀，AdvantageA10，美國MilliQ公司生產。

2方法與結果

2.1水和魚體中OLA的檢測水中OLA和MQCA的檢測采用0.22μm水相濾膜過濾后進液相色譜-質譜測定的方法。魚體中OLA的檢測通常需經過提取-凈化去蛋白雜質-(濃縮)-HPLC/MS的過程，提取方式主要有快速溶劑提取[9](E)，超聲提取[10](SSE)等方式；MQCA通常采用堿液提取的方式[11]。兼顧提取效率和操作可行性，并實現OLA和MQCA的同步檢測，本實驗采用了超聲熱提取的方式；同時，由于斑馬魚個體較小，組織構成同其他魚類、畜禽也有較大不同，本實驗對提取、凈化的過程進行了優化，以獲得準確可靠的檢測方法。

2.1.1超聲提取功率的篩選魚樣采集后，采用瑪瑙研缽將其研成肉沫狀，以乙腈作為提取溶劑，用量20mL/次，提取兩次；提取溫度為40℃，分別在40%、60%和90%的超聲功率下進行提取(每個功率下設置3個平行)，提取時間選擇15min。提取完成后，采用過無水硫酸鋅+中性氧化鋁去雜質的凈化方式，凈化液經旋轉蒸發濃縮、乙腈定容，用HPLC-MS測定。

2.1.2凈化劑的篩選在優化的超聲提取條件下，比較液-固萃取和液-液萃取的凈化效率，即分別采用無水硫酸鋅+中性氧化鋁+無水硫酸鈉和正己烷去脂去蛋白的凈化方式，凈化液經旋轉蒸發濃縮后，以乙腈定容、HPLC-MS測定。整個實驗過程采用避光的措施，以降低OLA見光分解的影響。

2.1.3HPLC-MS測試條件HPLC條件分別配制1.0ppm的OLA和1.0ppmMQCA的乙腈-水溶液，選擇WatersAcquityUPLCC18色譜柱(50mm×2.1mm，1.7μm)，流動相為甲醇：0.1%甲酸=50:50，流速為0.1mL/min，進樣量5μL，柱溫30℃。MS條件：ESI方式，正離子掃描，毛細管電壓310kv，離子源溫度120℃，脫溶劑氣溫度350℃，脫溶劑氣流量600L/h，錐孔氣流量50L/h。多反應監測(MRM)模式下定量分析時母離子、子離子、碰撞電壓及能量見表1。

2.2生物富集試驗方法

2.2.1試驗濃度的設定本研究中，預設試驗安全濃度為10mg/L，進行96h急性毒性測試。經過96h毒性測試，未見受試斑馬魚死亡。權衡喹乙醇的水溶性和對比度要求，選擇1/10和1/40的兩個濃度水平：即1.0和0.25mg/L作為生物富集試驗濃度。

2.2.2富集試驗考慮受試物OLA具有易光解的特性，參照相關準則，采用半靜態試驗法每24h更換一次藥液。設定的1.0和0.25mg/L的兩個處理，每個處理設2個平行，溶液體積為10L，受試魚50尾。同時作不添加受試藥的空白對照。在試驗開始后的0、24、48、96、144和192h采集水樣和魚樣，檢測其中OLA和MQCA的含量。

2.2.3數據處理若實驗結束時魚體中農藥含量變化已達到平衡，則魚體對供試物的富集系數按公式(1)計算。如果在試驗結束時，魚體中農藥濃度尚未達到平衡，則用上述公式求出的富集系數值用8d的結果BCF8d表示。此外，數據的統計分析采用Excel軟件，應用“公式”功能對平均值和相對標準偏差(RSD)進行模擬計算。

2.3結果

2.3.1HPLC-MS定量分析OLA及MQCA以乙腈-水(V:V=1:1)配制質量濃度為0.01~1mg/L的OLA和MQCA系列標準溶液，經過HPLC-MS測試，采用外標法定量，獲得OLA測定的標準曲線方程為：y=1075x-12.612，線性系數r=0.9992；MQCA的標準曲線方程為y=2232.7x-35.464，線性系數r=0.9998(圖1)。由結果可見，在0.01~1mg/L的濃度范圍內，兩種受試物的HPLC-MS測試符合線性方程，該工作曲線可用于生物富集實驗濃度的計算。

2.3.2斑馬魚內目標物提取凈化方式的優化(1)超聲效率的比較通常采用熱水或在適度增溫的條件下進行魚體內OLA的提取，采用正己烷或固相萃取柱進行凈化[10-11]；同時，對于MQCA的提取，通常采用酸水解、堿水解或酶解的方式[12]。而為實現OLA和其代謝物的同步提取，提高提取效率，本實驗采用乙腈做提取劑，設計40℃提取溫度，設置40%，60%和90%3個超聲功率，對斑馬魚體內OLA和MQCA的提取效率試驗結果見表2。由表2可知，2個添加水平下，60%的超聲提取功率提取魚體中OLA和MQCA的效率最高，OLA的回收率在72%~75%；MQCA的回收率在94%~102%。40%的超聲功率偏低，可能會使受試物提取不完全；90%的超聲功率偏高，會造成受試物分解導致提取效率下降。(2)凈化方式的影響60%的超聲功率下，分別采用無水硫酸鋅+中性氧化鋁+無水硫酸鈉和正己烷去除雜質脂肪和蛋白，獲得的回收率試驗結果見表3。魚類的脂肪和蛋白均會對目標物的測定產生一定的影響：或干擾儀器測定的基線導致檢測限降低，或使定容液分層干擾測定結果。選擇合適的凈化方式可提高測定的準確度和精密度。通過對比凈化效率，表明無水硫酸鋅+中性氧化鋁+無水硫酸鈉的凈化方式提取魚體中的OLA效率更高，方法穩定性也更高；對于MQCA，正己烷去雜質的效果更高，回收率可達90%~112%，無水硫酸鋅+中性氧化鋁+無水硫酸鈉的回收率在75%~76%，也可滿足測定要求；從方法的穩定性比較，后者的穩定性更高。綜合考慮，應選擇無水硫酸鋅+中性氧化鋁+無水硫酸鈉的凈化方式。按照以上的提取凈化方法進行檢測限測試，確定方法的檢測限為水中3μg/L，魚體4μg/kg，可滿足富集試驗測試需求。

2.3.3生物富集實驗結果(1)OLA在斑馬魚體內的生物富集特性8d的生物富集周期內，2個測試濃度下OLA的生物富集特性實驗結果見圖2。由圖2可見，在0.25mg/L的暴露條件下，OLA在魚體內的最大富集量出現在第4天，生物富集系數BCF值為0.30；在1mg/L的暴露條件下，OLA在魚體內的最大富集量出現在第6天，生物富集系數BCF值為0.18，參照相關評價標準，在本實驗條件下，OLA對斑馬魚的生物富集性為低富集性。實驗過程中未有斑馬魚死亡，空白對照組中未檢出受試物，試驗期間，溶液pH值范圍在6.98~7.27；溫度在24.7℃~25.2℃，DO變化范圍為4.7~5.5mg/L,本試驗結果表明，相比其他有毒化學品[13-14]，OLA的生物富集性較低。(2)代謝物MQCA在魚體中的產生變化規律在8d的生物富集周期內，斑馬魚體內的MQCA殘留狀況測試結果見圖3。由圖3可見，在0.25mg/LOLA的暴露濃度下，MQCA在魚體內的最大殘留量出現在第4d，殘留濃度為0.013mg/kg；在1mg/L的OLA暴露濃度下，MQCA在魚體內的最大殘留量出現在第2d，殘留濃度為0.016mg/kg。可見MQCA在魚體內產生濃度較低，對水體中MQCA的跟蹤監測表明，水體中濃度≤0.001mg/L。

3討論

鑒于OLA的毒性和潛在危害，關于其及代謝物MQCA的檢測、生態毒理學等生態安全性評價研究也越來越深入。曾靜等[10]報道采用60℃熱水作為提取劑，并用乙腈和正己烷去脂和去蛋白并采用HPLC-MS進行測定，方法檢出限為10μg/kg；謝小華等[11]采用乙腈作為提取劑，正己烷去脂，HPLC-UV檢測，方法檢出限為2μg/kg；對于MQCA的提取，堿水解反應劇烈，且反應后需調節pH值至中性，酶解條件溫和，但需較長反應時間；吳玉杰[12]報道了檢測魚體中MQCA的方法，樣品在酸性條件下水解，經乙酸乙酯、磷酸鹽緩沖液依次提取，OisMAX固相萃取柱凈化，紫外檢測器檢測。方法檢出限為2.6μg/kg。于海霞[15]采用堿水解-高效液相色譜法檢測草魚肌肉組織中的MQCA，方法檢出限為4.0μg/kg，回收率在80.5%~86.5%。相比以上方法，本實驗采用超聲熱提取-柱層析凈化-HPLC/MS的檢測方式，操作更為簡便，在保證低檢出限和高穩定性的前提下，可實現OLA和MQCA的同步檢出，提高了方法的效率和經濟性。

徐韻等[16]研究了OLA對水生生物的毒理學，96h的急性毒性實驗表明其對生生物為低毒。汪開毓等[17]腹腔注射法測得OLA在鯉魚體內的蓄積系數為1.45~1.90。楊先樂等[18]采用飼料投喂法測定OLA在鯉和銀鯽體內的蓄積，證明其在不同器官組織中的蓄積量在0.11~10.10mg/kg。統計分析數據表明在以上暴露方式下喹乙醇具有中度至明顯的蓄積毒性。在本研究中采用直接水溶液暴露的染毒方式，獲得的斑馬魚生物富集系數為0.18~0.30。同時發現不同的OLA暴露水平下，魚體中OLA的富集濃度均是呈現先上升，后逐漸降低的趨勢；作為OLA的主要代謝物，魚體中MQCA殘留濃度的變化趨勢是先增大，而后略降低并達到平衡狀態，同時由于OLA較低的生物富集性，其在魚體內的富集濃度并不是隨其溶液中暴露濃度增大呈線性增加，甚至在低暴露濃度下的富集性更高，導致其代謝物MQCA的平衡濃度差距不大。上述結果也表明了染毒方式不同，化學污染物在生物體內的富集結果也有較大的差別。本試驗結果為OLA對生物體的慢性毒性評價提供了基礎數據，圍繞本實驗結果可進一步討論在水溶液暴露染毒方式下，慢性蓄積毒性的狀況。

作者：孔祥吉 王娜 許靜 郭欣妍 孔德洋 單正軍 單位：環境保護部南京環境科學研究所 國家環境保護農藥環境風險評價與污染控制重點實驗室