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摘要：

2015年6月湖北某農(nóng)戶(hù)飼養(yǎng)的150頭的育肥豬，先后出現(xiàn)了弓背喜臥、糞便干結(jié)、全身皮膚出血等癥狀。病理剖檢可見(jiàn)全身皮膚及心、肝、脾、肺、腎、胃、膀胱等多臟器廣泛出血斑；采集病豬病變組織，提取RNA，用豬瘟病毒基因特異性引物進(jìn)行RT-PCR檢測(cè)，瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示，病料呈豬瘟病毒核酸陽(yáng)性，確診病豬為豬瘟病毒感染。

關(guān)鍵詞：

豬瘟；病理剖檢；RT-PCR檢測(cè)

豬瘟（ClassicalSwineFever，CSF），曾稱(chēng)為豬霍亂（HogCholera，HC），在我國(guó)俗稱(chēng)爛腸瘟。其是由黃病毒科瘟病毒屬的豬瘟病毒（CSFV）引起的豬的一種以高熱稽留、全身廣泛性出血、敗血和母豬繁殖障礙為特征的熱性高度致死性傳染病，曾經(jīng)給我國(guó)及世界養(yǎng)豬業(yè)的發(fā)展造成了巨大損失［1-2］。隨著豬瘟疫苗的廣泛使用，豬瘟在世界范圍內(nèi)得到了一定程度的控制，有的國(guó)家已經(jīng)消滅了豬瘟［3-4］。近年我國(guó)雖無(wú)大規(guī)模豬瘟疫情暴發(fā)，但豬瘟仍不時(shí)在一些不注重防疫的中小型養(yǎng)殖場(chǎng)或農(nóng)戶(hù)飼養(yǎng)的豬群中散發(fā)或流行。2015年6月湖北某農(nóng)戶(hù)飼養(yǎng)的150頭育肥豬，先后出現(xiàn)了弓背喜臥、被毛粗亂、糞便干結(jié)、眼角分泌物增多，隨后腹部及四肢內(nèi)側(cè)出現(xiàn)出血斑等癥狀，經(jīng)病理剖檢和RT-PCR診斷確診為豬瘟病毒感染。

1材料與方法

1.1試驗(yàn)材料湖北某農(nóng)戶(hù)飼養(yǎng)的育肥豬病豬及剖檢采集的淋巴結(jié)和腎臟等病變組織。分子生物學(xué)試劑：Trizol試劑、RT試劑盒為Invitrogen產(chǎn)品；ExTaq酶，dNTP等PCR相關(guān)試劑為寶生物（大連）有限公司產(chǎn)品，PCR引物參照已報(bào)道的豬瘟病毒Alfort株的基因序列E2保守區(qū)［5-7］設(shè)計(jì)1對(duì)引物HCV-F/HCV-R，擴(kuò)增目標(biāo)片段大小約為440bp，引物由武漢擎科創(chuàng)新生物技術(shù)有限公司合成，序列分別。

1.2試驗(yàn)方法

1.2.1臨床診斷與剖檢：觀察和記錄豬群病豬臨床癥狀，剖檢死亡豬只，檢查大體病變，并采取具有典型病變的組織，-70℃冷凍備用。

1.2.2總RNA提取：總RNA提取，按Trizol試劑盒操作說(shuō)明進(jìn)行：取具有明顯病變的淋巴結(jié)或腎臟約100mg，置于1.5mLEP管中，加入1mLTrizol，放入磁力組織破碎勻漿器具中，勻漿破碎10min，室溫靜置10min，加入200μL氯仿，用力顛倒離心管以混勻，靜置2min，12000r/min離心10min，取上層水相移至新EP管中，加入等體積的異丙醇，振蕩混勻，-20℃冰箱靜置20min，12000r/min，高速離心15min，棄上清液。加入300μL75%酒精振蕩洗滌，12000r/min離心，棄上清液。室溫靜置10mim，加入RNasefree水，-70℃冷凍保存。

1.2.3RT-PCR反應(yīng)及電泳：RT反應(yīng)采用20μL體系:5×Buffer4μL，10mM的dNTP1μL，40U/μL的RNaseinhibitor1μL，2mM的引物PR2μL，5U/μL的AMV反轉(zhuǎn)錄酶2μL，待檢RNA2.5μL，RNasefreeH2O7.5μL加入PCR管中，置PCR儀中。反應(yīng)條件為：42℃60min，95℃5min，4℃10min。PCR采用25μL反應(yīng)體系：10×ExBuffer（Mg2+）2.5μL，2.5mMdNTP2μL，HCV-F/HCV-R各1μL，反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物1μL，ExTaq0.25μL，H2O17.25μL。反應(yīng)條件為94℃預(yù)變性3min；94℃30s，55℃30s，72℃40s，30循環(huán)；72℃10min；4℃10min。PCR產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠進(jìn)行檢測(cè)。

2試驗(yàn)結(jié)果

2.1臨床癥狀臨床觀察豬群，豬只多被毛粗亂、弓背喜臥、眼角可見(jiàn)分泌物和淚斑，有的豬只糞便干結(jié)，有的稀薄，部分豬只腹部及四肢內(nèi)側(cè)皮膚可見(jiàn)出血斑等癥狀。

2.2剖檢病變對(duì)死亡的豬只進(jìn)行剖檢，可見(jiàn)病豬心肌及心冠脂肪出血明顯；脾臟明顯梗死，邊緣呈鋸齒狀；腎臟表面可見(jiàn)針尖狀出血點(diǎn)，膀胱內(nèi)膜出血有大小不一的出血斑，胃內(nèi)膜出血并有潰瘍斑，見(jiàn)圖1。

2.3RT-PCR結(jié)果提取病變淋巴結(jié)和腎臟組織總RNA，用參照已發(fā)表的豬瘟病毒序列E2保守區(qū)設(shè)計(jì)合成的豬瘟特異性引物，進(jìn)行豬瘟病毒核酸RT-PCR檢測(cè)，結(jié)果擴(kuò)增出了約440bp的條帶，顯示病料呈豬瘟核酸陽(yáng)性，見(jiàn)圖2。

3討論

典型的豬瘟往往是由強(qiáng)毒株引起的，開(kāi)始時(shí)豬群內(nèi)可能僅有個(gè)別豬只食欲減少，神情呆滯，弓背垂尾，體溫升高，便秘［5］。隨著病程的發(fā)展，豬群內(nèi)有更多的豬發(fā)病，最初的病豬可能食欲廢絕，出現(xiàn)眼結(jié)膜炎，兩眼有多量黏液膿性分泌物，隨后下痢，有的發(fā)生嘔吐、驚厥，出現(xiàn)步態(tài)不穩(wěn)等衰弱癥狀，常在幾天內(nèi)死亡。

近年來(lái)，豬瘟的流行和發(fā)病特點(diǎn)已轉(zhuǎn)變?yōu)橐苑堑湫拓i瘟為主的流行形式，出現(xiàn)了臨床癥狀顯著減輕，發(fā)病率較低，潛伏期及病程較長(zhǎng)多呈散發(fā)的溫和型豬瘟，這些病例往往病變不明顯，常需依賴(lài)實(shí)驗(yàn)室診斷才能確診［6］。該研究通過(guò)對(duì)豬群進(jìn)行臨床觀察，發(fā)現(xiàn)豬群癥狀符合豬瘟臨床癥狀。對(duì)死亡病豬進(jìn)行剖檢發(fā)現(xiàn)，心臟、心冠脂肪、腎臟、膀胱及胃內(nèi)膜等內(nèi)臟器官?gòu)V泛性出血；脾臟梗死，邊緣呈鋸齒狀，呈現(xiàn)典型的豬瘟示病癥狀［7］。在臨床診斷、病理剖檢的基礎(chǔ)上進(jìn)一步進(jìn)行RT-PCR病原分子生物學(xué)檢測(cè)，擴(kuò)增出了豬瘟病毒核酸，確診該豬群為豬瘟感染。對(duì)發(fā)病原因進(jìn)行調(diào)查分析發(fā)現(xiàn)，養(yǎng)殖戶(hù)一直未對(duì)豬群進(jìn)行豬瘟疫苗免疫，可能是造成該次發(fā)病的主要原因。這種免不免疫都無(wú)所謂的僥幸心理也有可能正是造成當(dāng)前豬瘟在我國(guó)中小型養(yǎng)殖場(chǎng)和養(yǎng)殖戶(hù)的豬群中仍時(shí)有發(fā)生的根本原因。因此，中小型養(yǎng)殖戶(hù)一定要提高防疫意識(shí)，采取積極有效的免疫措施，進(jìn)行科學(xué)養(yǎng)殖，方能降低風(fēng)險(xiǎn)，提高養(yǎng)殖經(jīng)濟(jì)效益。

作者：楊超 單位：襄陽(yáng)正大農(nóng)牧食品有限公司 長(zhǎng)江大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院