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《家畜生態學報》2017年第5期

［摘要］豬瘟是由豬瘟病毒引起的危害極大的一種傳染病，具有高度的傳染性和致死性，利用疫苗控制該病的流行是世界各國使用的廣泛策略。e2亞單位疫苗具有安全性好、穩定性強的特點，且具有自然感染和接種疫苗的抗體差異，是未來新型疫苗研究的方向之一。本文綜述了E2亞單位疫苗的保護效力、影響因素及未來發展方向。

［關鍵詞］豬瘟；E2糖蛋白；亞單位

疫苗豬瘟（Classical swine fever，CSF），也稱“爛腸瘟”，是一種由豬瘟病毒引起的傳染性極強的病毒性疾病，臨床上表現為急性、亞急性、慢性或溫和型等形式，也可以呈現亞臨床形式感染，是危害養豬業健康發展的主要傳染病之一?？刂艭SF流行的主要策略是系統化的預防接種和非疫苗的防控措施如消毒、檢疫、隔離、無害化處理等，其中疫苗的使用一直受到世界各國的廣泛重視。弱毒疫苗如我國科學家研制的豬瘟兔化弱毒疫苗，對該病的控制起到了很大的積極作用。日本由于改良活疫苗的使用，在1993和2003年之間沒有爆發CSF［1］。然而，單純依賴MLV疫苗接種來消除豬瘟面臨一定的困難，因為動物在自然感染和接種疫苗（MLV）產生的抗體差異即血清學DIVA是很難區分的，這就影響臨床工作中的快速篩查和國際貿易。為了克服這個問題，歐盟在1999年開始大規模試驗研究E2蛋白亞單位疫苗，并且成功誘導免疫豬產生抗CSF的免疫保護［2］。

1CSFV的致病機理

豬瘟最常見的感染途徑是經呼吸道感染，當動物口鼻接觸CSFV后，病毒在扁桃體開始復制，感染上皮細胞、巨噬細胞、淋巴細胞和內皮細胞，然后擴散到其他淋巴結。高致病性病毒可迅速分布整個身體，病毒組織中含量更高，可誘導更嚴重的病理變化［3］。在急性病例中，CSF可引起全身出血和免疫抑制，其作用機制是通過下調細胞因子和免疫細胞，包括內皮細胞、淋巴細胞、單核／巨噬細胞和骨髓造血干細胞（骨髓）等來實現的。豬瘟病毒可以誘導內皮細胞壞死，引起血管炎和出血，并伴有嚴重的貧血、血小板減少及干擾纖維蛋白原的合成，從而引起全身性出血。骨髓和B淋巴細胞、粒細胞、T淋巴細胞的減少和壞死可引起免疫抑制。豬瘟病毒通過線粒體跨膜電位和Erns蛋白直接或間接誘導的淋巴細胞凋亡。此外，豬瘟病毒可以誘導TNF－α的產生，促進B淋巴細胞的凋亡。

2E2亞單位疫苗的保護效力

E2包膜糖蛋白是豬瘟病毒的主要保護性抗原，在CSFV感染時誘導中和抗體的產生，E2蛋白已被證明是一個最有效的免疫原［4］。經過深入的研究，重組E2蛋白亞單位疫苗已經商業化，比如BAYO－VAC○R和Porcilis○R。從接種后14d到13個月，該疫苗足以提供有力的免疫保護［5－6］。然而，單劑量疫苗在免疫接種第7天不能提供保護，在第10天有部分保護作用［5］。在第21d，疫苗誘導產生中和抗體，持續6個月［6］。有報道稱，在疫苗接種后14d，可以完全阻止病毒傳播［7］。病毒疫苗株因基因同源或異源存在免疫效力的差異，單次疫苗接種后可以在10d、14d防止病毒水平傳播并維持6個月的保護力，也有報道稱疫苗接種后21d防止病毒水平傳播［5－6，8］。E2亞單位疫苗可以減少垂直傳播，但不能完全預防垂直傳播。在疫苗首次免疫之后可以發生母嬰傳播，即使二免之后仍可以發生母嬰傳播［9］。E2亞單位疫苗接種后，存在感染和接種差異，即DIVA，這種優勢有利于快速篩查受感染的豬，幫助控制和消除CSF［4］。

3影響保護效力的因素

3．1E2糖蛋白抗原結構和抗原表位研究

E2抗原結構和抗原表位具有重要意義，可以為疫苗的改進提供科學依據。研究者基于E2蛋白抗原表位的預測人工合成了多肽Pep1和Pep2，進一步的研究表明Pep1具有很好的反應原性和免疫原性［10］?？茖W研究表明E2糖蛋白具有四個抗原結構域即B／C／D／A，所有結構域位于E2糖蛋白N－末端的一半［11］。結構域A又被分為A1、A2和A3，E2的非保守表位位于B／C。其中，A1抗原亞區位于E2蛋白791～858位氨基酸區域。科學研究揭示了E2抗原結構模型，結構域B／C是由C693和C737之間的二硫鍵固定，A／D域由兩個二硫鍵形成：一個是在C792和C856之間；另一個在C818和C828之間。在結構域B／C中，753RYLASLHKKALPT765和771LLFD774對維持構象表位的結構完整性是必不可少的［12］。

在B／C中，E713和D729決定基因型2和3型毒株的抗原特異性；D705和K761決定基因1型LPC疫苗株的抗原特異性［13］。在D／A結構域中，R845決定基因型1和3的抗原特異性［11］。具有抗原決定作用的構象表位E902，決定基因型1和2的抗原特異性，存在于C－末端區［11］。E2糖蛋白具有幾個重要的線性表位抗原，比如在772LFDGTNP778中的線性表位抗原。在結構域A中，一個高度保守的中和線性表位抗原829TAVSPTTLR837通過使用單克隆抗體（mAb）WH303進行了鑒定，已被用于基于表位的疫苗開發［14－17］。該單克隆抗體WH303已使用廣泛的免疫組化標記，但WH303具有MLV病毒標志抗原，因此不能用于DIVA，不能進行快速篩查。在E2C端區域，研究發現具有一個病毒線性表位995yyep998之間高度保守的結構［11］。亞單位疫苗表現為非復制單抗原，以單體或二聚物的形式存在，不是錨釘在病毒包膜。像其他蛋白質一樣，注射E2抗原的量在接種后將隨時間而發生衰減，所以在臨床實踐中，都需要二次疫苗接種。

3．2母源抗體的影響

研究發現，3周齡的仔豬母源抗體含量最高；在5或7周齡第一劑量亞單位疫苗，4周后加強亞單位疫苗免疫接種的仔豬具有很高的中和抗體［18］。在2周齡（即仍具有母源抗體時）接種疫苗，機體產生的抗體效價顯著低于3、6個月后仔豬抗體的滴度［19］。

3．3抗原性差異的影響

兩種商業化的豬瘟病毒E2亞單位疫苗來源于布雷西亞毒株基因型1．2和AlfortTübingen基因型1．1。但是，有研究表明，在大多數歐洲和亞洲國家，自然分離獲得的CSFVs已經從原來的基因型1或3變異成基因型2［20］。在我國，疫苗病毒的基因型與目前流行的病毒基因型也存在一定的差異［21］。豬瘟病毒的基因型特異性血清，與外源E2蛋白結合的有效性比同源的E2蛋白低，表明在CSFVs中E2的差異對交叉中和作用至關重要［22－23］?；蛐蛄械母淖兛赡軐е翬2糖蛋白結構的變化，因此弄清楚亞單位疫苗和豬瘟流行病毒株之間的交叉保護問題至關重要。然而，目前生產的兩個商業化CS－FVE2亞單位疫苗（基因型1．1和1．2）對異源菌株如帕德博恩（Paderborn）基因型2．1不能提供完全保護。不同基因型的病毒的抗原性變異可以通過交叉中和試驗進行評價，同源毒株之間的NT抗體顯著高于異源毒株。

總之，這些研究表明，不同基因型的毒株之間間存在抗原差異，從而影響免疫保護效果?；畈《净蛑亟ME2蛋白可以誘導機體產生抗體，這種抗體中對基因同源毒株的作用優于對異源毒株的作用，由活病毒引起的抗體滴度比重組蛋白高。血清交叉中和顯示基因同源株比異源株高，這種差異與單克隆抗體的氨基酸差異有關。豬瘟病毒不同基因型間的抗原變異通過豬瘟病毒特異性單克隆抗體的不同反應模式被證實［22－23］。E2特異單克隆抗體對同源菌株具有很好的結合和中和作用［22－23］。研究表明，B／C結構域中H710，H724，N725，D729，K734，M738的單點突變和D／A結構域中T823，P833，T834，R837的單點突變可以導致中和單克隆抗體結合性質的喪失。在710位置的氨基酸殘基可以影響單克隆抗體的結合和中和［24］。在B／C結構域的D705，E713，D729和K761殘基、在A結構域的R845殘基，以及在C－末端區域的E902殘基是基因型1，2或3的抗原特異性的關鍵因素［11，13］。最近研究表明，基因型2的E2蛋白抗原區變異可以影響血清反應性，其中E37N和V45Q兩個位點置換具有顯著影響，其可能與E2蛋白的構象變化密切相關［25］。

4小結

4．1E2亞單位疫苗的優勢

E2亞單位疫苗僅含病毒的保護性抗原，不含病毒的其他組成成分，不包含遺傳信息，因此與活疫苗相比具有安全性好、穩定性強的特點，在生產工藝上無需進行滅活處理。在臨床應用時存在一個很大的優勢，接種后具有感染和接種的差異性，即DIVA，是典型的DIVA疫苗，從而有利于臨床實踐中的快速篩查。Erns和NS3ELISAs可以用于檢測E2亞單位疫苗，chekit○R比priocheck○R豬瘟病毒的敏感性較高［4］。4．2面臨的挑戰E2亞單位疫苗保護效果差，低于MLV，研究表明，中國株疫苗比E2疫苗能提前1～2周建立有效的群體免疫。除此之外，E2亞單位疫苗不能完全預防垂直傳播，有報道稱，在疫苗首次免疫之后可以發生母嬰傳播，即使二免之后仍可以發生母嬰傳播［9］。在免疫反應方面，E2亞單位疫苗只能誘導抗體反應，免疫原性比較低，通常需要采用相應的方法如佐劑或載體等。而且E2亞單位疫苗的生產成本比常規疫苗高，這也給該疫苗大規模的商業化生產和推廣應用帶來一個難題。另外，豬瘟病毒變異毒株的產生是豬瘟控制面臨的難題之一，E2亞單位疫苗如何應對豬瘟病毒基因型變異也是不得不面臨的一個挑戰。

4．3未來發展趨勢

疫苗的開發要求克服各種影響，提高免疫保護效力。在一般情況下，E2亞單位疫苗只能誘導抗體反應，那么提高疫苗T細胞免疫反應可能成為未來疫苗開發的努力方向之一，在亞單位疫苗誘導有效的細胞免疫反應將會引起越來越多研究者的興趣。蛋白質組學方法為亞單位疫苗和佐劑研究提供了新的機會，可在將來與結構生物學方法相聯合來提高T細胞反應的預測［26］。最近研究表明，桿狀病毒可以誘導兔E2糖蛋白的表達產生保護性免疫反應，證實了CSFV－1．1E2和CSFV－1．1＋2．1E2不僅引起體液和細胞介導的免疫反應，而且在兔體中提供了對CSFVC株的完全保護［27］。除此之外，通過重組可以提高酵母豬瘟病毒囊膜糖蛋白E2的表達［28］。國內研究者進行了E2基因工程亞單位疫苗的研究，通過兩次免疫小鼠產生了特異性抗體，其滴度可達1∶1500［29］。通過基因工程技術實現了豬瘟病毒E2蛋白在大腸桿菌中的表達［30］。有研究表明，母豬免疫基因工程E2亞單位疫苗具有低的病毒載量和高的中和抗體滴度［31］。E2和E0聯合使用具有協同作用，該發現為新型亞單位疫苗候選抗原的研究提供了參考［32］。人類醫學對亞單位疫苗的研究如登革熱重組亞單位疫苗的研究等也可以為E2亞單位疫苗的研究提供借鑒思路［33］。利用基因重組技術生產E2亞單位疫苗將受到越來越多的關注，重組E2的設計應包括中和保守的構象和線性表位，考慮抗原特異性殘基的變化，保持抗原免疫原性。除此之外，增強免疫效力，降低生產成本，以及臨床實際應用方面都可能成為未來的研究熱點。

作者：呂永智 單位：重慶三峽職業學院