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《現(xiàn)代畜牧獸醫(yī)雜志》2014年第七期

1方法

1.1CSFV的檢測取采集的仔豬脾臟和淋巴結(jié)組織約1g于研磨器充分研磨，用Hanks液1:5稀釋，反復(fù)凍融3次，8000r/min離心10min，取上清液400μL，加入800μLTrizol，混勻后室溫放置5min。加入200μL氯仿，旋渦振蕩15s混勻，室溫下放置2～3min，12000r/min離心10min。取上清轉(zhuǎn)移到新的EP管，再加入500μL異丙醇混勻，室溫下放置10min。12000r/min離心10min，棄上清，再加入75%酒精1000μL，旋渦振蕩混勻，12000r/min離心5min，晾干，用適量無RNzse水溶解RNA。然后取提取的RNA10μL，Primer（P2下游）1μL，70℃5min，置于冰上2min，加入5×RTBuffer4μL，10mmol/LdNTPMixture2μL，40U/μLRNaseInhibitor1μL，混勻，37℃5min，加入5U/μLAMVRe-verseTranscriptaseXL1μL42℃2.5h，70℃10min放于冰上待用。將合成的cDNA（CSFV）作為模板，進行PCR擴增。反應(yīng)體系為25μL，其中10×Taq酶Buffer（Mg2+）2.5μL，MgCl2+5U/μLTaq酶1μL，2.5mmoL/LdNTP2μL，10μmol/L的P1P2上下游引物各1μL，CSFV的CDNA5μL，H2O3μL。混勻后置于PCR儀中擴增。反應(yīng)程序為：94℃預(yù)變性5min，進行30循環(huán)（94℃30s、50℃40s、72℃1min），72℃延伸10min，最后降溫至4℃結(jié)束。取PCR產(chǎn)物與10×DNA樣緩沖液混合，在1%瓊脂糖凝膠上電泳20min，用溴化乙錠染色，50V電壓電泳1h左右后，在紫外檢測儀下觀察電泳結(jié)果。

1.2CSFV陽性重組子的鑒定與測序使用小量膠回收試劑盒（上海華瞬生物工程有限公司）進行。取純化的DNA樣品，進行電泳，觀察其純度。然后與pMD18-T載體進行連接，連接反應(yīng)總體積10μL，16℃連接過夜；反應(yīng)完畢后，全量轉(zhuǎn)化TG1感受態(tài)細胞。涂布于含有IPTG、Xgal和Amp+LB的瓊脂平板，37℃培養(yǎng)過夜。挑取單菌落于5mL含Amp+的LB液體培養(yǎng)基中，37℃震蕩培養(yǎng)過夜，按《分子克隆實驗指南》的堿裂解法小劑量制備質(zhì)粒的步驟進行陽性質(zhì)粒提取。根據(jù)Primer5.0軟件對CSFV基因的cDNA參考序列和pMD18-T載體的質(zhì)粒圖譜用Hin-dIII、BamHI進行重組質(zhì)粒的酶切鑒定。用0.8%瓊脂糖凝膠電泳分析酶切結(jié)果。再用PCR鑒定CSFV陽性重組子，將鑒定正確的陽性重組子送大連寶生物工程公司測序。

1.3血清抗體的檢測用血清稀釋液對陽性和陰性標準血清做1:20稀釋，每孔50μL，陰、陽性標準血清各做2孔；待檢血清樣品用血清稀釋液做1:20稀釋，同時設(shè)2孔不加任何血清樣品的空白對照孔。密封，37℃結(jié)合45min。洗板：棄去孔內(nèi)液體，然后將25倍洗滌液用滅菌水或超純水稀釋成1倍工作液，每孔加入220～300μL洗板，反復(fù)4次，最后一次棄凈孔內(nèi)液體。加入酶標二抗：濃縮酶標記抗體用血清稀釋液做1:100稀釋，每孔加入50μL，密封，37℃結(jié)合45min（注意：從加入第一孔時開始計時間）。重復(fù)洗板步驟。加入底物：將底物A和B作1:50體積混勻，每孔加入50μL，輕輕震蕩混勻，密封。37℃避光作用15min。加樣的順序應(yīng)同加入酶標二抗保持一致，從加入第一孔時開始計時間。終止反應(yīng)：每孔加入50μL終止液，輕搖混勻，測定吸光度OD490nm。

2結(jié)果與分析

2.1CSFV的檢測結(jié)果由圖1可見，用RT-PCR方法，以逆轉(zhuǎn)錄合成的的cDNA為模板，用引物P1、P2擴增出約288bp的目的片段，與預(yù)計的理論值相符。表明發(fā)病豬場的病豬的病原為豬瘟病毒。

2.2CSFV序列測定及同源性比較結(jié)果見圖2。分離株與GenBank中發(fā)表的同源毒株序列進行比較，其核苷酸同源性為89.41%。從進化樹的關(guān)系上看引起發(fā)病的病毒與32在同一聚類上。3.3血清抗體檢測結(jié)果結(jié)果判定：根據(jù)OD490值計算P/N值（陽性血清OD940值/陰性血清OD490值，其中P為標準陽性血清的OD490，N為2孔標準陰性血清的平均OD490）。當P/N值≥5，表示試驗成立，然后根據(jù)S/N值對待檢血清進行判定（S為待檢血清的OD490值），陰性為S/N≤1.5，可疑為1.5≤S/N≤2，陽性為S/N＞2，抗體保護臨界值為S/N≥2.5。在散養(yǎng)豬場所采60份母豬血清中，S/N≥2.5的有2孔，占3.3%，2≤S/N≤2.5的為0，1.5≤S/N≤2的有6孔，占10%，S/N≤1.5的有40孔，占80%。據(jù)判定標準和S/N值計算結(jié)果表明，被檢測的60頭仔豬免疫都沒有達到抗體保護臨界值，陽性反應(yīng)的僅占3.3%，說明豬瘟免疫失敗。

3討論

本研究表明，黑龍江省某養(yǎng)豬戶仔豬散發(fā)病死亡的病原為豬瘟病毒。抗體檢測結(jié)果顯示，豬瘟抗體保護率僅為3.3%，母豬的免疫效果差，使得仔豬不能從母乳中獲得充足的母源抗體達到防控豬瘟的目的。在飼養(yǎng)管理不佳、環(huán)境污染嚴重、應(yīng)激等情況下仔豬易感染野毒引發(fā)亞臨床豬瘟[4]。該養(yǎng)豬戶采用一般的春秋兩季免疫豬瘟疫苗。春秋兩季正是春種和秋收最忙的季節(jié)，因農(nóng)戶家經(jīng)常沒人，從而未能及時接種豬瘟疫苗，致使統(tǒng)一免疫免疫密度不能得到完全的保證，另一方面疫苗對溫度的要求也較高，農(nóng)村條件有限，稀釋以后的疫苗如不能及時接種，保存不當會存在失效的可能。

這些因素可能都直接或間接地導(dǎo)致了豬瘟免疫合格率低，母豬易成為隱性感染者。該養(yǎng)豬戶種母豬帶毒會產(chǎn)出免疫系統(tǒng)不健全或持續(xù)感染的仔豬，引起仔豬發(fā)生亞臨床豬瘟。或者仔豬攝入母源抗體少，抗體消失早，也易感染豬瘟病毒，進而形成了疾病的傳播鏈。因此，在豬瘟的控制過程中，保證種豬有一個較高的穩(wěn)定的豬瘟抗體水平具有至關(guān)重要的作用；同時，淘汰隱性感染的母豬，減少仔豬感染的機會。配合新生仔豬的超前免疫，并加強消毒、隔離等預(yù)防措施，可以保證仔豬健康。

作者：吳凌白云龍冉旭華夏成邵紅單位：黑龍江省八一農(nóng)墾大學(xué)動物科技學(xué)院