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摘要:采用原花青素交聯和仿生礦化技術,以生物相容性良好的細菌纖維素(BC)為原材料制備了BC/多肽(pol)和BC/多肽/羥基磷灰石(HAp)復合材料,并利用場發射掃描電鏡、X射線衍射儀和紅外光譜儀對制備材料進行分析表征,采用成骨細胞評估了幾種支架材料的生物相容性。結果表明,交聯和仿生礦化成功地將pol和HAp引入到BC的表面和內部,細胞實驗表明,3種支架材料均具有一定的生物相容性,且復合改性提高了支架材料的生物活性,制備的材料具有優異的性能,是具有應用前景的組織工程支架材料。

關鍵詞:細菌纖維素;多肽;復合;羥基磷灰石;生物相容性

近年來,隨著人們對組織工程發展的需要,用于組織工程支架的材料越來越多,并取得了顯著成效。細菌纖維素(BC)作為一種天然的納米纖維材料因其獨特的性能被認為是構建新一代仿生納米組織工程支架的理想材料。其主要特點為:制備簡單,力學性能優異,結構與體內細胞外基質(ECM)存在相似性易于塑形,自身呈三維網狀結構,結晶度和純度高,不含有植物纖維素中的木質素和半纖維素,良好的生物相容性,生物合成可調控,復合改性方法多樣化等。因此,BC成為近幾年生物材料領域新的研究熱點,在許多組織工程領域具有極好的前景。BC納米纖維雖然具有與天然納米膠原纖維相似的形貌,但是作為天然多糖類,是一種惰性材料。為使BC納米纖維更好地模擬天然ECM,需要在纖維表面固定生物活性物質。許多研究學者,對BC表面通過活性物質進行了表面改性或活化處理,其生物學實驗結果理想,對細胞、組織在支架材料上生長起到有益的作用[1~4]。本實驗選擇大豆多肽(pol)和羥基磷灰石(HAp)為研究對象,研究其與BC納米纖維的復合工藝及形成的復合材料的結構和性質。大豆多肽蛋白水解產物,其成分與膠原存在共性,是一種短肽混合物,具有很高的生物活性且成本低,可以被人體直接吸收,是一種理想的生物材料。HAp是自然骨的主要組成部分,具有良好的生物相容性,是極具潛力的人體硬組織修復材料。因此,pol和HAp作為性能優異的生物材料,是常用的組織支架構建材料,能為細胞的黏附、增殖和分化提供更多的活性,改善BC的細胞粘附性,提高其生物活性。實驗中,選擇葡萄籽提取物原花青素(PA)作為穩定的天然交聯劑,將pol與BC復合,然后采用仿生礦化的方法,在BC/pol的納米纖維表面沉積HAp包覆層,制備BC/pol/HAp復合材料,對其結構、性能進行表征,并分析其生物相容性。

1實驗部分

1.1試劑與儀器BC:紅茶菌發酵分泌獲得,其過程見1.2節中BC的培養;紅茶菌:自制,質量分數0.5%的紅茶和質量分數10%的葡萄糖,煮成茶糖水,放涼后倒進玻璃瓶紗布封口,置于常溫、陰涼處,發酵15d,即得到紅茶菌菌種,作為母液備用;去離子水:實驗室采用重慶艾科浦AJF系列基礎分析型超純水機自制去離子水;模擬體液(SBF):自制,配制方法依次加入NaCl8g,KCl0.2g,Na2HPO41.44g,KH2PO40.24g,溶于800mL去離子水中,經pH計檢測、鹽酸稀釋液調pH至7.4,定容至1000mL,試劑為分析純,國藥集團化學試劑有限公司;大豆多肽:純度99.8%,山東康勤生物科技有限公司;原花青素:純度95%,上海仟爵生物科技有限公司;氫氧化鈉、氯化鈣、葡萄糖、乙醇:分析純,國藥集團化學試劑有限公司。磁力控溫攪拌器:上海麥尚科學儀器有限公司;恒溫箱:深圳市易世達儀器設備有限公司;立式高壓滅菌鍋:濟南博鑫生物技術有限公司;超聲清洗機:杭州法蘭特超聲波科技有限公司。

1.2樣品制備BC的培養:將去離子水煮沸,加入質量分數0.5%的紅茶和質量分數10%的葡萄糖,浸泡20min后濾去茶葉渣,靜置冷卻。然后加入高溫滅菌處理的培養燒杯、錐形瓶中,接種紅茶菌,靜置培養7d,取液面上層菌膜。BC的清洗純化:BC膜用蒸餾水多次沖洗,再用質量分數1%的NaOH溶液反復加熱清洗,以除去殘存的菌體和培養基,用去離子水反復沖洗至中性后,浸泡去離子水中,冷藏,待用。BC/多肽復合材料(BC/pol)制備:將清洗后的BC置于質量分數為0.5%的pol溶液中,溫度為37℃,攪拌6h,再將其取出浸于質量分數0.5%的PA溶液中,溫度為37℃,攪拌2h。反應結束后,獲得PA交聯的BC/pol復合材料,將復合材料取出后清洗,待用。BC/多肽/HAp復合材料(BC/pol/HAp)制備:將BC/pol復合材料浸于CaCl2溶液(0.1mol/L),在37℃恒溫箱中靜置3d后取出浸入SBF中,繼續置于37℃恒溫箱中,每2d換一次SBF,放置7d后取出,清洗,待用。

1.3測試與表征

1.3.1SEM測試:采用場發射掃描電子顯微鏡(FE-SEM)觀察樣品的微觀形貌。在測試之前,先將樣品用導電膠粘附在樣品臺上,采用離子濺射儀對樣品表面進行噴金(5mA,5min)。1.3.2XRD測試:采用X射線衍射儀(XRD)對試樣晶體結構分析(電壓40kV,電流強度200mA,掃描范圍為1°~60°)。1.3.3FT-IR測試:采用傅里葉變換紅外光譜儀(FT-IR)測試樣品,分辨率為4cm-1,波數范圍為400~4000cm-1。

1.3.4支架材料的生物相容性評價:支架材料的生物相容性評價選用成骨細胞,通過倒置顯微鏡和噻唑鹽微量酶反應比色法(MTT)測試細胞在支架材料上的生長、粘附和增殖情況。1.3.5成骨細胞誘導成骨分化能力的表征:通過堿性磷酸酶(ALP)活性測定,表征成骨細胞誘導成骨分化的能力。

2結果與討論

Fig.1是BC、BC/pol和BC/pol/HAp3種材料的微觀形貌。從圖中可以看出,3種試樣都保持了三維網絡結構,但是隨著包覆沉積的pol和HAp顆粒,試樣的微觀網絡結構改變,孔隙的尺寸和含量都降低。從Fig.1(a)中可以看出,純BC試樣保持良好的三維立體網絡結構,孔隙直徑多變,適合組織、細胞的生長粘附和營養物質的輸送,表面包覆pol之后(Fig.1(b)),納米纖維表面出現pol顆粒,可以為細胞、組織提供粘附位點,提高材料的生物相容性,但是從材料的微觀形貌可以看出,其孔隙率和孔隙尺寸都有下降,這一現象在表面沉積HAp后更加明顯(Fig.1(c))。將BC/pol仿生礦化處理之后,纖維表面形成均勻的HAp沉積層,包覆每根纖維,HAp作為生物相容性理想的納米顆粒,與BC復合后,希望能明顯改善材料的生物相容性和力學性能。

Fig.2是3種材料在400~4000cm-1范圍的FT-IR圖譜。從圖中可以看出,BC、BC/pol和BC/pol/HAp3種材料均在3360cm-1處有1個較寬的吸收峰,這是纖維素上羥基(-OH)的伸縮振動峰。同時,在3220cm-1也存在1個吸收峰,這是分子間氫鍵的吸收波數,表明纖維素Iα晶型是實驗中BC的主要成分。此外,曲線在2900cm-1和1376cm-1附近的吸收峰分別是對應C-H鍵的伸縮振動和C-H鍵的彎曲振動。CH2的對稱彎曲振動引起的紅外吸收峰則位于1428cm-1處,897cm-1的吸收峰對應于C-H的變形振動。這些特征官能團的存在證明主體材料纖維素的存在[4~6]。對比Fig.2中(a)和(b),2條曲線在1620cm-1和1530cm-1位置發現了明顯的特征峰,分別對應酰胺Ⅰ鍵(C=O)和酰胺Ⅱ鍵(N-H)的振動吸收峰[4]。這2個特征峰的出現證明了pol的存在,這一結果與FE-SEM結果一致。此外,在Fig.2(c)中還發現了HAp磷氧鍵(960cm-1)和CO32-(1420cm-1和870cm-1)的特征吸收帶[5,7],說明在BC/pol/HAp復合材料上仿生礦化得到的HAp也是缺鈣性磷灰石,與人體自然骨的主要成分磷灰石相類似。

Fig.3是BC(a),BC/pol(b)和BC/pol/HAp(c)3種材料的XRD譜圖。從圖中可以看出,在衍射角14°、16°和22°位置上出現了衍射峰,對應BC的特征晶面((110)、(110)和(020))的衍射峰,證明高結晶度的BC存在[8~10]。其中Fig.3中(b)和(c)2條曲線,在18°位置上出現饅頭峰,這是由于結晶度差的高分子物質pol的存在導致的,這與FE-SEM和FT-IR結果相一致,證明了復合材料中成功引入pol。從Fig.3(c)中看出,在2θ=25.9°和2θ=31.7°位置都出現了明顯的衍射峰,對比標準譜圖發現,這2個衍射峰對應Hap在(002)和(211)晶面的衍射峰[5]。從Fig.3(c)中還可以發現HAp的衍射峰與標準衍射峰對比相對寬化,研究發現仿生礦化得到的HAp結晶度較低,晶粒細小,人體自然骨中的HAp也有這一形貌結構特性。對比BC、pol和HAp的特征衍射峰,在對應位置都有顯示,這一結果說明,經過交聯復合和仿生礦化,pol和HAp成功引入納米纖維的表面,2種物質先后在納米纖維表面形成包覆層,隨著包覆層種類和厚度的增加,基體BC的特征吸收峰的相對強度受影響,這也與FE-SEM和FT-IR的測試結果相吻合。

作為一種潛在的組織工程支架材料,其生物相容性、對細胞的粘附程度、生物毒性的大小等是決定其應用前景的關鍵因素,因此對制備材料生物性能的初步評價也是材料應用的前提,因此,本實驗首先采用MTT法對成骨細胞在BC(a),BC/pol(b)和BC/pol/HAp(c)3種材料上的增殖能力進行檢測,實驗結果Fig.4所示。從實驗結果發現,3種材料中,細胞在培養周期均有很好地生長,保持持續的增殖。與普通BC相比,BC/pol(b)和BC/pol/HAp(c)上細胞的增殖速度更快,復合改性改善了材料的生物活性。此外,細胞增殖速率先快后慢,在增殖初期,支架中的養分和空間充足,細胞可以較快地獲取新鮮的養分用于生長擴增。隨著時間延長,受養分供給和空間減少的影響,細胞的增殖速率減緩,這一現象與細胞的生長過程相關。因此,MTT結果表明,BC,BC/pol和BC/pol/HAp3種材料均可以支持細胞的生長增殖,對細胞的生長和增殖沒有副作用,有一定的生物相容性,復合改性提高了材料的生物活性[9],也是由于引進了生物活性更為優異的pol和HAp包覆層所致,引入活性分子既可以為細胞的生長增殖提供營養,也可以為細胞的粘附提供活性點,實現了提高支架生物相容性的預期目的,細胞在3種材料上的增殖能力的強弱順序為BC/pol/HAp>BC/pol>BC。

Fig.5是在3種支架材料中接種成骨細胞培養3d后材料邊緣位置的光學顯微鏡照片((a)BC,(b)BC/pol和(c)BC/pol/HAp)。從圖中可以看出,由于3種試樣材料本身不透光,不能直接通過光學顯微鏡觀察細胞在其表面和內部的生長情況,但是在培養液中和支架的邊緣處,細胞都有很好的粘附和生長,這一現象證明接種細胞的支架材料本身都是無毒性的,在培養液中浸泡接觸沒有析出對細胞生長有毒性的成分,這一結果與MTT結果相一致,3種支架材料都有一定的生物相容性,同樣表現出在BC/pol和BC/pol/HAp材料中細胞的數量多于純BC支架的增殖現象。成骨細胞在體內外的生長分化和基因表達一般包括生長增殖期、基質形成及成熟期和基質鈣化期。其中基質形成及成熟期伴隨著堿性磷酸酶(ALP)活性升高,因此,成骨細胞在支架材料中生命狀態可以通過ALP的高低間接表達,ALP可以反映成骨細胞的增殖和分化程度以及對骨基質形成和膠原合成的能力[5]。

Fig.6給出了本實驗中接種成骨細胞的3種支架材料中的ALP活性,結果顯示,隨著培養時間的延長,3種支架材料中細胞的ALP活性都持續增加,尤其是BC/pol/HAp支架中,細胞的ALP活性最高,增長最快,這也與支架中引入了類似自然骨的主要成分HAp有密切關系,HAp的存在進一步增加了成骨細胞的增殖和誘導成骨分化能力,這一實驗結果證明了復合改性對改善材料生物活性的效果[10]。

3結論

采用PA交聯法和仿生礦化可制備BC/pol和BC/pol/HAp復合材料。FE-SEM、XRD和FT-IR結果表明,pol和HAp顆粒成功引入到BC材料的表面和內部,在納米纖維的表面形成均勻的包覆層,支架材料的孔隙率和孔隙變小,結構更加緊密,但仍然保持材料三維網絡立體結構。通過細胞實驗,將成骨細胞接種到3種支架材料中,經過培養后,細胞都有明顯的生長增殖,細胞在BC/pol和BC/pol/HAp2種支架上的生長情況優于BC材料,復合改性提高了材料的生物相容性,其中BC/pol/HAp支架材料的生物活性最佳,成骨細胞接種后,大量增殖,并保持了誘導成骨分化的能力,3種支架材料都具有良好的生物活性,在組織工程領域有一定的應用前景。

作者：王靜;徐俊青;吳寧;毛麗賀 單位：天津工業大學