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基因載體主要有病毒載體和非病毒載體。病毒載體的基因轉運能力強,但其攜帶基因的大小數量有限,而且在臨床應用上存在安全性問題(王海等.2006)。非病毒載體具有低毒、低免疫反應,外源基因隨機整合率低且攜帶基因大小類型受限制等優點,已成為基因治療中的熱點和當前藥劑學研究的前沿課題。隨著人類基因組計劃的完成和后基因組計劃的實施,功能基因不斷涌現。如何將所需的功能基因導入受體細胞是基因研究中的關鍵步驟,因此開發安全有效的基因傳遞載體成為了當前研究的重要工作之一。對于非病毒載體,其基因傳遞方法又可分為物理法(carrier-freegenedeliver-y)和化學法(syntheticgenedelivery)。因此,無論是基因載體還是傳遞方法的發展都將對基因治療產生深遠的影響。《JournalofGeneMedicine》對2008年在臨床基因治療中所用載體的類型和各期基因臨床試驗的情況進行了調查。該調查發現在載體材料的使用中,腺病毒載體占24·9%(367例),為各種載體之首,但進入III期臨床試驗的基因治療占3·2%(47例)。也就是說在基因治療的臨床應用上,研究者變得更謹慎和小心,就目前基因治療的狀況而言,安全性,即致畸、致癌和致突變,靶向特異性及體內轉染效率等問題,已成為基因治療所遇到的瓶頸問題。因此,如何研制出安全有效的、生物相容性好的基因藥物載體,如何提高非病毒性基因載體的靶向特異性和體內外轉染效率,已經是迫在眉睫的關鍵問題。

1基因載體的種類

基因治療載體可分兩大類:病毒性載體和非病毒性載體。

2病毒性載體

病毒性載體如逆轉錄病毒、腺病毒、腺相關病毒、痘苗病毒、皰疹病毒等。逆轉錄病毒應用最早,研究也相當深入,目前仍被廣泛應用。雖其經改造后去除了病原性,保留了高的基因轉染效率,但因制備困難、目的基因容量小、靶向特異性差,以及自身免疫原性和生物安全性問題,限制了它們的應用。特別是1999年出現首例因使用腺病毒載體而致病人死亡的事件發生后美國許多科研機構已停止使用病毒類載體,重點轉向非病毒類載體研究。

3非病毒載體的研究進展

理想的非病毒載體需要滿足以下條件:(1)保護DNA不被細胞外DNA降解酶的降解;(2)攜帶DNA穿透細胞膜;(3)保護DNA在進入核前不被細胞內容酶體和酶等降解;(4)能有效將有活性的基因插入目的區;(5)可生物降解,從細胞中消除;(6)無細胞毒性[1]。目前非病毒基因載體的研究主要集中于以下幾個方面:

3.1陽離子多聚物載體陽離子多聚物/DNA混合物稱為polyplex。陽離子多聚物(polycation)可濃縮富含陰離子的DNA,然后粘附到細胞表面的硫酸粘多糖上,被細胞內吞進入細胞內,從而使質粒表達。報道的陽離子多聚物種類很多,如聚乙烯亞胺(polyethylenimine,PEI),聚丙烯亞胺樹突狀物(polypropyleniminedendrimers),聚酰胺樹突狀物(poly-amidoaminedendrimer),多聚賴氨酸、多聚組氨酸、多聚精氨酸、魚精蛋白、殼聚糖(chitosan)等以及上述聚合物的聚乙二醇修飾物。其中研究較早的是多聚賴氨酸,后來發現聚乙烯亞胺性能更佳,是目前研究的熱點。PEI可抑制溶酶體,在吞噬泡酸性環境中質子化、正電荷增加,對DNA提供更大的保護作用,有利于質粒逃離吞噬泡[2]。PEI糖基化或聚乙二醇化增加了其生物兼容性,陽離子多聚物/DNA混合物經PEG修飾后,可形成囊泡狀結構,屏蔽表面多余的正電荷,有利于體內應用。

3.2納米顆粒載體納米顆粒載體介導基因轉染具有其他非病毒載體所沒有的優勢。首先,納米顆粒在一定范圍內的顆粒數目對細胞的生長及活性無明顯影響,細胞毒性和遺傳毒性較其他載體低很多;同時納米載體不存在免疫原性,因而不會導致免疫反應的發生。其次,納米顆粒傳遞基因的效率較高。很多納米材料作為載體傳遞基因的效率與脂質體相當甚至高于脂質體。第三,由于自身體積小,納米顆粒可以在血管中隨血液循環,并可通過血腦屏障到達身體各組織中。最后,納米顆粒在體內的循環時間明顯長于普通大小的顆粒,在短時間內不會很快被吞噬細胞清除,從而可以延長與細胞的接觸時間,提高轉染效率。同時,納米顆粒還可與DNA形成致密結構,使DNA不被核酸酶消化降解,有濃縮保護DNA的作用。目前研究較多的納米粒主要有無機納米粒(如磷酸鈣、磁性氧化鐵)、固體脂質納米粒、可降解聚合物納米粒(如PLA、PLGA)、天然高分子納米粒(如殼聚糖及其衍生物)、有機硅納米粒等。

3.3脂質體脂質體DNA復合物又稱為lipoplexes。應用的轉基因脂質體分陽性、中性脂質體、陰性脂質體以及pH-敏感的脂質體。陽性脂質體,體外應用較多,如商品化的Lipofec-tin。在脂質和DNA的復合物中加入少量多聚賴氨酸或魚精蛋白復合物等可形成類似病毒樣的顆粒,減少了復合物間的凝聚,增加了對DNA的結合力,提高了脂質體在體外的轉染效率。陽離子脂質體結構一般包括疏水基團和氨基基團,增加分子中氨基基團的數目,以及增加氨基基團與疏水基團之間的距離有利于增加DNA的釋放能力。陽離子脂質體與DNA形成的復合物顆粒大小從50nm到1um不等,體外細胞試驗,大顆粒的轉染效率優于小顆粒。脂質體經聚乙二醇(PEG)修飾后,可降低脂質體-DNA復合物顆粒之間的相互聚集,降低了與血液成分的相互作用,使脂質體DNA復合物顆粒由大顆粒變成小顆粒,同時不影響脂質體與細胞的親和力,但體外試驗,陽離子脂質體聚乙二醇化降低了轉染效率[3]。另外,將脂質體與配體結合形成導向脂質體可增加轉染效率,如葉酸導向的pH-敏感脂質體可用于葉酸受體表達增加的許多腫瘤細胞系[4],抗轉鐵蛋白受體單抗偶聯的PEG化的中性脂質體包裹質粒,體內應用,可廣泛轉染外周組織和腦[5]。

脂質體是由磷脂雙層構成的具有水相內核的脂質微囊,其作為抗癌藥物的載體對癌細胞,具有靶向性、無免疫原性、緩釋時間長、毒副作用低及載藥率高等優點。由于脂質體既能包封脂溶性藥物,又能包封水溶性藥物,在腫瘤治療中顯示出明顯的優越性。近年來,國內外研究者在脂質體的制備工藝、表面修飾、靶向性等方面進行了廣泛研究,前體脂質體、長循環脂質體、陽離子脂質體等新型脂質體不斷涌現,為脂質體的臨床應用開辟了廣闊前景。前體脂質體是在普通脂質體制劑中加入一定量的固相載體,通過不同的干燥工藝使其形成動性較好,易在水中分散或溶解的粉末[6]。North等[7]用脂質體包裹腫瘤相關抗原BLP25制成腫瘤疫苗,用于治療非小細胞肺癌和前列腺癌患者,延長了患者的存活時間。Richards等人[8]將脂質體包被的多柔比星(ADR)對胃癌患者進行瘤周黏膜下注射,與單獨注射游離ADR比較,其在淋巴結內藥物濃度明顯提高,而且持續時間長、毒副作用小、抗癌療效高。3·4聚乙烯亞胺(polyethylenimine,PEI)研究表明,PEI在體內外均有較高的轉染效率,但是PEI不易被細胞內的酶代謝,易在核內聚集,引起細胞毒性。因此,需對PEI進行改性,使聚乙烯亞胺表面聚乙二醇化,即“PEGylation”,以減小其毒性。其中將聚乙二醇與聚乙烯亞胺共聚、聚乙二醇與聚乙烯亞胺偶合和聚乙二醇對聚乙烯亞胺進行物理包裹等都是可選擇的策略。因為聚乙二醇的介入,使聚乙烯亞胺與DNA所形成的微粒在血液循環中穩定性增加,防止微粒在生理條件下聚集和沉淀。Thomas等用不同分子量的聚乙二醇偶合于PEI25kDa上,發現PEG在PEI所形成的微粒有不同的結構形式,如核殼結構(core-shellstructure)和均相結構(homogenous-s),其中均相結構微粒易被細胞吞噬。他們還將三元共聚化合物hy-PEI-g-PCL-b-PEG應用于基因藥物的釋放,該共聚物的特點是可生物降解[9]。Kim將半乳糖和聚乙烯亞胺通過活性聚乙二醇的“橋”連接起來,同時利用活性VS-PEG-NHS將RGD短肽鍵合于載體材料,偶合配體的聚乙烯亞胺在基因轉染實驗中均顯示靶向細胞選擇性[10]。

3·5生物相容性載體材料為解決基因載體材料生物相容性的問題,天然高分子生物材料如膠原、透明質酸、殼聚糖和海藻酸鹽等被用于基因藥物載體的研究。其中殼聚糖及其衍生物在基因載體系統的研究最為廣泛。Leong等[11]將殼聚糖先與DNA形成復合物微粒,把聚乙二醇(NHS-PEG-MAL)偶合于復合物微粒上,將腫瘤細胞上具有靶向受體表達的轉鐵蛋白(transf-errin)偶合在復合物微粒上,形成一種組裝式、靶向性的轉基因藥物載體,該組裝式載體在HEK293細胞株上具有很高的轉染效率。Chong等[12]將聚乙烯亞胺(25kDa)偶合于殼聚糖上制成母體材料,然后把靶向于肝細胞的半乳糖基鍵合于母體材料上,制成具有靶向肝細胞的基因藥物載體。他們還將殼聚糖進行苷露糖化作為靶向于巨噬細胞的苷露糖受體,以作為鼻腔內免疫體的輔助釋放系統。除殼聚糖外,植物多糖也是一類良好的載體材料。大量的藥理試驗證明,多糖類藥物主要作用于免疫系統、血液系統和消化系統等。作為基因藥物載體,多數植物多糖的結構本身不能與質粒DNA結合,因此需要用化學方法對植物多糖的結構進行修飾改性。由于植物多糖的糖苷環結構中帶有豐富的羥基、羰基等,為載體本身的活化提供了可能性。Takeda[13]等報道了用天然裂褶多糖(schizophyllan,SPG)、聚乙烯亞胺和質粒DNA三元復合物在抗原遞呈細胞上被細胞吞噬攝取的研究,用原子顯微鏡觀察了細胞的吞噬過程,結果發現該復合物易被細胞吞噬,說明糖羥基的存在易使復合物在細胞膜表面黏附及攝取。環糊精(cyclodextrin,CyD)是直鏈淀粉在由芽孢桿菌產生的環糊精葡萄糖基轉移酶作用下生成的一系列環狀低聚糖,其中具有重要意義的是含有6、7、8個葡萄糖單元分子的A、B、C-環糊精。在基因藥物載體中,由于其所具有的活潑羥基基團,可以與聚陽離子材料(聚賴氨酸、聚乙烯亞胺及樹枝狀高分子載體材料)結合,制成具有生物相容性、可生物降解的基因藥物載體系統。Davis等[14]報道用分子量為25kDa的直線型和樹枝狀聚乙烯亞胺,分別偶合于經過活化的B-環糊精上,制得β-CyD-LPEI和β-CyD-bPEI,對所合成的載體材料進行體外細胞學實驗和體內動物實驗。我們課題組用B-環糊精上的活潑羥基,用N,N’-二羰基咪唑對環糊精進行修飾,將低分子量的聚乙烯亞胺偶合于B-環糊精上,得到了滿意的體內外轉染效率[15-17]。Li用B-環糊精為核,將聚乙二醇穿過B-環糊精的空穴,再將小分子的聚乙烯亞胺偶合于B-環糊精的表面羥基上,形成一個多功能的組合式基因藥物載體,所合成的載體材料極易溶于水體系中,且有很強的DNA縮合能力,在HEK293細胞上表現出良好的轉染效率[18]。同時,用低分子量的聚乙烯亞胺經N,N’-二羰基咪唑活化后,偶合于B-環糊精的7個羥基上,形成一個以B-環糊精為核、聚乙烯亞胺為側基的樹枝狀聚合物,為B-環糊精-聚陽離子材料在基因藥物的研究領域開創了新的方法。

3.6多功能信封式納米載體(MEND)多功能信封式納米載體(Multifunctionalenvelope-typenanodevice)[19]是由日本人Hi-deyoshiHarashima提出的基于程序組裝的一種新型的復合載體系統。理想的MEND是由壓縮的DNA核心和含有靶向因子及功能配體的脂質信封外殼構成。首先,采用多聚陽離子如PLL、PEI將DNA壓縮,這樣可以保護DNA不受核酸酶的降解,控制DNA復合物的大小及提高DNA的包封率。其次將多聚陽離子/DNA復合物通過與脂質體間的水合作用和靜電相互作用包裹入脂質體中。最后對脂質體進行修飾達到不同的功能,如PEG化和靶向作用。這種新型的復合載體系統綜合了各種載體系統所具有的優點,具有顯著的促進基因的細胞轉染潛在優勢,因而有著廣闊的發展前景。

4配體介導的靶向載體

要使非病毒載體能在腫瘤細胞或特異組織中定向遷移并攜帶DNA進行細胞轉染,就需要在載體表面進行靶向基團修飾,使其具有靶向特異性。葉酸、轉鐵蛋白、半乳糖、TAT肽及膽甾醇等靶向配體偶合于載體上可以提高載體的靶向性。

4·1葉酸受體研究表明葉酸受體在大部分惡性腫瘤細胞表面均有過度表達。葉酸受體主要有α-FR、β-FR和γ-FR三種亞型,其中α-FR在卵巢癌、子宮癌、睪丸癌、肺癌等一些上皮組織的惡性腫瘤細胞中高表達;β-FR在頭頸部鱗狀細胞癌及一些非上皮來源的癌組織中高表達;γ-FR分布很少,主要在血液組織出現惡變時有過度表達。葉酸受體的表達水平與腫瘤的發展階段有關,早期腫瘤的葉酸受體表達較低,晚期及高度惡變的腫瘤受體表達增強。用殼聚糖為核心偶合聚乙二醇形成親水性的載體材料,再將葉酸偶聯于載體材料上,是一種有效改善殼聚糖性質的方法。Yang等報道殼聚糖經過聚乙二醇偶合后溶解性大為改善,再偶合葉酸配體后,該載體材料就成為一種具有一定靶向性的復合式基因載體[20]。

4.2轉鐵蛋白受體Wanger等將聚乙烯亞胺與轉鐵蛋白偶合制成Tf-PEI共聚物,對50種細胞進行了體外轉染實驗,發現Tf-PEI共聚物對10種腫瘤細胞的轉染具有較高的選擇性;同時,對動物進行了體內的研究,實驗結果表明其在腫瘤組織中的表達明顯高于其它組織器官。他們還用冷光共聚焦顯微鏡活體觀察了Tf-PEI/DNA和Tf-PEG-PEI/DNA復合物在荷瘤小鼠中的分布及在腫瘤部位的遷移、富集,為非病毒基因載體材料在動物體內的研究奠定了基礎[21]。

4.3短肽蛋白1988年Green和Franke研究小組[22]分別發現HIV-1的TAT短肽蛋白具有穿越細胞膜進入細胞的特性,隨后一批能跨膜的短肽蛋白相繼被發現,如Antp、VP22及Transportan等。這類具有穿膜功能的短肽被科學家統稱為細胞膜穿透肽(cell-membranepeneratingpeptide,CPPs)。CPPs不但自身具有穿透細胞膜的能力,而且能夠介導與其相連的各種載體材料跨膜進入細胞,這對于不能靠自身能力進入細胞的載體材料是個非常有意義的發現。因此,有許多課題組開展了短肽蛋白介導的穿膜體系研究,噬菌體展示技術已經篩選出許多具有靶向功能的短肽蛋白。Yang課題組將短肽TAT偶合于聚乙二醇-膽固醇載體材料上,形成雙功能靶向載體TAT-PEG-b-Cho,l其中TAT序列NH2-YGRKKRR-QRRR,結合FITC技術和量子點技術發現,該組裝式載體在腫瘤細胞具有極高的轉染效率[23]。湯谷平課題組將TAT、MC10和CY11等功能性靶向短肽偶合于PEI-CD載體材料上,在體外細胞轉染實驗中顯示出較強的腫瘤細胞選擇性[24-26]。存在于性激素靶器官腫瘤,而且還存在于一些非性激素靶器官腫瘤,如肺癌、甲狀腺腺瘤、腦膜瘤、黑色素瘤、食管癌、胰腺癌、肝癌等。這就為以激素介導的基因藥物治療腫瘤及其他疾病提供了可能。Yang課題組用葵二酰氯(sebacoylchloride)和N-甲基二乙醇胺(N–methyldie-thanolamine)合成聚(N-甲基二乙醇胺葵酯)[poly(N-methyldiethanolaminesebacate)]。配體膽甾醇則用溴乙胺(bromoethylamine)與酰氯化的膽甾醇(cholesterylchloroformate)在三乙胺作用下,活化3位碳上帶活性基團的膽甾醇,然后與上述兩個化合物結合,形成以聚(N-甲基二乙醇胺葵酯)為骨架結構,膽甾醇為側鏈配體的基因藥物載體。在HEK293、HepG2、4T1、HeLa、MDA–MB-231細胞株及骨髓干細胞上均表現為低細胞毒性和高轉染效率[27]。

5總結與展望

基因治療的關鍵是獲得有效進行基因傳釋的載體。病毒載體系統和非病毒載體系統均在深入研究,其目的是制備一個低免疫原性、有靶向性、無毒高效的基因治療載體。從長遠看,非病毒載體具有更好的臨床應用前景,因為它具有靶向性、低免疫原性、低成本、易規模化等病毒載體所沒有的顯著優點,但是,非病毒載體的研究尚處于嬰兒期,還存在著較多未解決的問題,例如,如何克服核膜障礙、如何降低血清成分干擾、長期應用是否存在安全性問題、如何提高通過受體獲取靶向性的成功率、如何取得大量臨床數據的支持等。因此,非病毒載體仍有待于隨著基礎科學的進一步研究而得到不斷的發展。非病毒載體具有廣闊的應用前景,但只有通過眾多科研工作者的共同努力才能使其最終廣泛用于基因治療。