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摘要：觀察牛磺酸對N甲基D天冬氨酸(NmethylDaspartate，NMDA)興奮毒性引起的大鼠視網膜組織結構及超微結構損傷的保護作用。方法在大鼠玻璃體腔內每眼注射5μl4mmol/LNMDA造成視網膜興奮毒性損傷模型，20只成年雄性SD大鼠隨機分為4組：正常對照組；NMDA組；NMDA+?；撬岣深A組(腹腔注射25mg/kg?；撬?；磷酸鹽緩沖液(PBS)對照組。玻璃體注射后第4d，測量視網膜總厚度及內層厚度并用透射電鏡觀察視網膜超微結構。結果NMDA使大鼠視網膜總厚度尤其是視網膜內層厚度變薄(P＜0001)，超微結構顯示內核層及節細胞層神經元發生變性改變，25mg/kg?；撬岣深A可有效保護視網膜組織結構，削弱NMDA引起的視網膜超微結構損傷。結論?；撬嵩隗w內可有效保護NMDA引起的視網膜組織結構及超微結構損傷。

關鍵詞：?；撬酦甲基D天冬氨酸興奮毒性視網膜超微結構

興奮性氨基酸(EAA)引起的興奮毒性是糖尿病視網膜病變〔1〕、青光眼、視網膜變性等疾病的視網膜神經元損傷及死亡的主要機制之一。體內研究表明，視網膜的興奮毒性主要由N甲基D天冬氨酸(NmethylDaspartate,NMDA)受體介導〔2〕。?；撬?Taurine)是視網膜含量最豐富的游離氨基酸，近年來發現，牛磺酸可以保護培養的小腦顆粒細胞對抗興奮毒性損傷〔3〕。本實驗通過在大鼠玻璃體內注射NMDA制備視網膜興奮毒性損傷模型，觀察?；撬釋MDA誘導的視網膜組織結構及超微結構損傷的保護作用。

1、材料與方法

1、1實驗動物及視網膜NMDA興奮毒性損傷動物模型的建立成年雄性SpragueDawley大鼠20只，體質量200～250g(第三軍醫大學野戰外科研究所實驗動物中心)，實驗動物質量合格證號：SCXK(軍)2002008。大鼠腹腔注射速眠新注射液01ml/100g(長春軍需大學獸醫研究所)麻醉，5%托品酰胺散瞳，1%利多卡因進行角膜表面麻醉，用微量注射器從顳上方鞏膜距角膜緣外3mm處進針，見針尖到達玻璃體中后部后，緩慢注入5μl4mmol/L的NMDA〔2〕。潔霉素滴眼預防感染。眼瞎大鼠棄去。

1、2實驗分組20只大鼠按隨機數字表法分為4組：(1)正常對照組；(2)NMDA組；(3)NMDA+牛磺酸干預組；(4)磷酸鹽緩沖液(PBS)對照組；每組5只大鼠。正常對照組不進行任何處理；NMDA組為上述模型組；牛磺酸干預組于眼內注射NMDA前1h及其后每天腹腔注射?；撬?25mg/kg〔4〕)，共注射3d；PBS對照組于玻璃體內注射5μl01mol/LPBS。玻璃體注射后第4d觀察指標變化。NMDA、?；撬?美國Sigma公司)，用無菌01mol/LPBS稀釋。

1、3視網膜組織病理學觀察及視網膜厚度測量腹腔注射2ml/100g03%戊巴比妥鈉處死大鼠，迅速摘取右眼，去除前節、晶狀體及玻璃體，將眼杯用10%福爾馬林固定，常規石蠟包埋，經視乳頭切片(5μm)，蘇木精伊紅(HE)染色，觀察視網膜組織結構并照相，LEICAQWIN圖像分析軟件于距視乳頭中心15mm處雙側測量視網膜全層及視見網膜內層(包括內核層、內網狀層、節細胞層和神經纖維層)厚度，每只眼球取6張切片，每組5只大鼠結果求平均值。

14視網膜超微結構觀察按前法處死大鼠，摘取左眼，將眼杯迅速置于4℃預冷的3%戊二醛固定，常規1%钅我酸固定，系列丙酮脫水，環氧樹脂浸透包埋，經光鏡定位后行超薄切片，于TENCAI10PHILIPS透射電鏡下觀察視網膜各層細胞的超微結構。

15統計分析采用SPSS統計軟件處理，組間比較用單因素方差分析。

2、結果

2、1視網膜組織病理結構改變及視網膜厚度測量

表1各組視網膜總厚度及視網膜內層厚度測量結果

HE染色及視網膜厚度測量結果顯示，玻璃體內注射NMDA后第4d，與未注射眼視網膜相比，視網膜總厚度變薄(P＜0001)，尤以視網膜內層厚度變薄明顯(P＜0001)，節細胞數有減少，而視網膜內、外段及外核層改變不明顯。牛磺酸干預使視網膜總厚度(P=0017)及內網狀層厚度(P=0001)較模型組增厚，節細胞的丟失減少。表明?；撬岣深A可有效保護NMDA興奮毒性對視網膜組織病理結構改變。

2、2玻璃體注射NMDA及?；撬岣深A對視網膜超微結構的影響透射電鏡觀察發現，玻璃體注射NMDA后第4d，視網膜內核層細胞及節細胞超微結構發生改變。鏡下可見，NMDA組：視細胞胞體無明顯病變，色素上皮細胞及盤膜正常，內核層神經元線粒體中、重度腫脹，嵴消失甚至空泡樣變，內質網嚴重擴張，節細胞部分軸突明顯腫脹，視神經纖維明顯腫脹甚至解體，整個內核層神經元及節細胞表現為變性改變。牛磺酸干預組：內核層細胞有輕度線粒體腫脹及內質網擴張，節細胞超微結構正常，僅部分節細胞見輕度線粒體腫脹和內質網擴張，視神經纖維層軸突腫脹不明顯，?；撬峤M超微結構改變較NMDA組明顯減輕。

3、討論

目前認為EAA引起的興奮毒性是糖尿病視網膜病變、青光眼、視網膜缺氧等的視網膜神經元死亡的主要機制之一。研究表明〔2〕，視網膜內層神經元的興奮毒性損傷主要由對NMDA受體的過度刺激引起，NMDA受體的各亞單位在視網膜主要見于內網狀層的突觸后神經元，即無足細胞和節細胞〔5〕。Lam等〔6〕用玻璃體內注射NMDA的大鼠模型發現，注射18h后內核層和節細胞層出現大量細胞凋亡。腹腔注射NMDA受體拮抗劑-MK801能有效預防NMDA對視網膜細胞的損傷〔7〕。將NMDA受體拮抗劑用于預防視網膜興奮毒性是一種值得探索的方向，但由于NMDA受體同時介導許多正常的生理功能，其拮抗劑用于人體可能對中樞神經系統產生多種副作用，使其臨床應用受到限制〔8〕。牛磺酸是一種正常存在于人體多種組織的游離氨基酸，目前公認?；撬崾且粋€調節及降低神經細胞內Ca2+水平的強有力因子〔9〕。有研究提示，?；撬峥赏ㄟ^防止或降低谷氨酸誘導的胞內Ca2+水平的升高而保護培養的大腦神經元〔3〕。我們研究發現，牛橫酸可保護大鼠糖尿病視網膜病變的組織結構及超微結構損傷〔10〕。本實驗發現，?；撬嵩隗w內可拮抗NMDA興奮毒性對視網膜組織結構及超微結構的損傷。由于目前未發現較高劑量的?；撬釘z入對人體有負面影響，提示將其用于預防EAA興奮毒性引起的視網膜神經元損傷可能有較好的臨床應用前景。