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1材料和方法

1.1試劑及主要實(shí)驗(yàn)儀器設(shè)備

α-MEM培養(yǎng)液（Hyclone，USA），膠原酶（TypeI，Sigma，USA），胎牛血清（杭州四季青），胰蛋白酶（配成0.25%,過濾分裝，冷凍保存），青霉素100U/ml，鏈霉素100mg/L；SABC免疫組織化學(xué)試劑盒（武漢博士德），角蛋白抗體及波絲蛋白抗體（武漢博士德），二氧化碳恒溫培養(yǎng)箱，倒置相差顯微鏡，血球計(jì)數(shù)板。

1.2方法

1.2.1組織塊法培養(yǎng)hPDL

（1）取材：選擇健康青少年（12～18歲）正畸拔除的健康的雙尖牙，超凈工作臺內(nèi)用刀片仔細(xì)刮除附著牙齦及根尖組織，用D-Hanks液沖洗3次；（2）無菌處理：將牙冠浸入5.25%次氯酸鈉溶液中2min，再用含高濃度雙抗的D-Haks液沖洗2遍。按照司徒鎮(zhèn)強(qiáng)［6］傳統(tǒng)組織塊培養(yǎng)法進(jìn)行原代培養(yǎng)；（3）傳代：細(xì)胞匯合至培養(yǎng)瓶80%時，用0.25%的胰蛋白酶消化液1∶2消化傳代。

1.2.2酶消化組織塊法培養(yǎng)hPDL

酶消化組織塊法原代培養(yǎng)在取材、無菌處理上與組織塊法相同。刮下根中2/3的牙周膜后，不剪，移入離心管內(nèi)。0.1%膠原酶37℃消化30min，其中，每5min振蕩1次，當(dāng)肉眼觀察到培養(yǎng)液略混濁，顯微鏡下見組織塊松散時，離心，棄上清液，用含血清及雙抗的培養(yǎng)基漂洗1次后棄上清液，收集組織塊，將組織塊平鋪于培養(yǎng)瓶底，翻轉(zhuǎn)培養(yǎng)瓶，向內(nèi)加入4ml培養(yǎng)液，置CO2培養(yǎng)箱孵育2h，使組織塊貼壁，再翻轉(zhuǎn)培養(yǎng)瓶培養(yǎng)；傳代與組織塊法相同。

1.2.3全牙消化法培養(yǎng)hPDL

全牙消化法原代培養(yǎng)牙周膜細(xì)胞取材、無菌處理與組織塊法相同。將牙齒放入裝有0.1%膠原酶的青霉素小瓶內(nèi)，牙根向下，使消化液浸沒牙根，37℃溫箱內(nèi)消化1h，用吸管充分吹打牙根表面，加入等量含血清的培養(yǎng)基，離心，棄上清液，加入3ml培養(yǎng)基（含10%胎牛血清、青霉素100U/ml、鏈霉素100mg/L）吹打形成細(xì)胞懸液，移入25ml培養(yǎng)瓶內(nèi)，置CO2培養(yǎng)箱內(nèi)進(jìn)行培養(yǎng)，3d換液1次，待細(xì)胞鋪至瓶底80%時用0.25%胰蛋白酶1∶2消化傳代。

1.3細(xì)胞的生長情況觀察

1.3.1倒置相差顯微鏡連續(xù)觀察細(xì)胞原代和傳代生長情況。

1.3.2HE染色

取生長狀態(tài)良好的第5代細(xì)胞進(jìn)行爬片，用蘇木精-伊紅染色，觀察細(xì)胞形態(tài)。

1.3.3細(xì)胞免疫化學(xué)染色

將培養(yǎng)的第3代hPDL接種于置有蓋玻片的培養(yǎng)瓶中，按常規(guī)SABC法操作，進(jìn)行波絲蛋白抗體、角蛋白抗體染色，光鏡下觀察染色情況。

1.3.4描繪細(xì)胞生長曲線

取3塊24孔板，分別取3種方法培養(yǎng)的第5代細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度為1×104個/ml接種于24孔板，每孔100μl，CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)4h后每孔加0.5ml培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)，每天每組各取3孔的細(xì)胞作細(xì)胞計(jì)數(shù)，連續(xù)觀察8d，繪制細(xì)胞生長曲線。

2結(jié)果

2.1形態(tài)學(xué)觀察3種方法培養(yǎng)的hPDL形態(tài)學(xué)上無太大區(qū)別，均呈長梭形或星形，胞突細(xì)長，胞體豐滿，胞漿均勻，中央有圓形或橢圓型的胞核，細(xì)胞呈放射狀、漩渦狀排列（見圖1～3）。HE染色胞核嗜堿性，胞漿嗜伊紅（見圖4）。

2.2免疫組織化學(xué)鑒定結(jié)果免疫組織化學(xué)實(shí)驗(yàn)顯示細(xì)胞波形絲蛋白染色陽性，角蛋白染色陰性，證明為中胚層組織來源（見圖5、圖6）。

2.33種方法培養(yǎng)的hPDL生長情況

2.3.1組織塊法

牙周膜組織塊經(jīng)靜置貼壁后，一般8～16d組織塊邊緣有細(xì)胞開始游出，以組織塊為中心成放射狀、漩渦狀生長，生長的細(xì)胞以1∶2傳代培養(yǎng)，最初5代的細(xì)胞3～5d即可長滿培養(yǎng)瓶底，生長狀態(tài)較活躍，核分裂相多見；6～12代細(xì)胞，7～10d匯合，細(xì)胞增殖穩(wěn)定。本實(shí)驗(yàn)用組織塊法培養(yǎng)牙周膜細(xì)胞培養(yǎng)了20例，成功1例，成功率5%。

2.3.2酶消化組織塊法

用此方法所培養(yǎng)的20例中，有4例在5～10d內(nèi)觀察到細(xì)胞游出，2例傳代成功。細(xì)胞以組織塊為中心呈放射狀排列生長。傳代后的細(xì)胞生長旺盛，狀態(tài)良好，原代培養(yǎng)成功率為10%。圖1組織塊周圍長出的牙周膜

2.3.3全牙消化法

最初消化下來的細(xì)胞為圓形，呈懸浮狀態(tài)。24h后細(xì)胞開始貼壁，48h后幾乎全部貼壁。貼壁后的細(xì)胞2～3d開始伸展變形，多數(shù)細(xì)胞形態(tài)呈長梭形或星形，少數(shù)呈扁平多角形。從第6天起，細(xì)胞生長加速，長梭形及星形細(xì)胞增殖活躍，多角形細(xì)胞生長相對較緩慢，細(xì)胞大約經(jīng)歷12d后開始形成單層，長梭形細(xì)胞占絕對優(yōu)勢。細(xì)胞傳至2～3代時可基本去除上皮樣細(xì)胞，4～10代細(xì)胞生長狀態(tài)較好，核分裂相多見，3～5d可長滿培養(yǎng)瓶底。用此方法原代培養(yǎng)20例，有4例傳代成功，成功率20%。

2.4細(xì)胞增殖情況及生長曲線從第5代牙周膜細(xì)胞的增殖數(shù)和生長曲線可以看出，3種方法培養(yǎng)的細(xì)胞增殖速度相近，生長曲線相似，均呈S型（見圖7）。

3討論

原代培養(yǎng)是從供體獲取組織后首次培養(yǎng)，主要應(yīng)用酶消化法和組織塊培養(yǎng)法，這2種方法在國內(nèi)外均有人采用，而且采用的組織比較廣泛，迄今為止，人們相繼利用豬、猴、牛等多種動物和人的拔除牙齒來培養(yǎng)牙周膜細(xì)胞［1～3］。國內(nèi)學(xué)者多采用組織塊法。上世紀(jì)70年代初，Arnold首先系統(tǒng)研究了組織塊法培養(yǎng)PDL和其生長特點(diǎn)［7］。國內(nèi)在這方面的研究起步較晚，最初在上世紀(jì)90年代報(bào)道了用組織塊法培養(yǎng)hPDL，目前對培養(yǎng)的方法正在不斷完善和改進(jìn)［8］。

本實(shí)驗(yàn)采用3種方法對PDL原代培養(yǎng)，其中，組織塊法培養(yǎng)的hPDL，原代培養(yǎng)時間較長，細(xì)胞傳代顯示，最初5代的細(xì)胞3～5d即可長滿培養(yǎng)瓶底，生長狀態(tài)較活躍，分裂相多見；6～12代細(xì)胞，7～10d匯合，細(xì)胞增殖穩(wěn)定，可為實(shí)驗(yàn)提供足量的細(xì)胞，適于進(jìn)行細(xì)胞形態(tài)、功能、生理、生物化學(xué)、分子生物學(xué)等多方面的實(shí)驗(yàn)。12～20代，細(xì)胞10～15d長滿瓶底，細(xì)胞增殖速度下降，營養(yǎng)狀況不佳，胞漿內(nèi)出現(xiàn)顆粒和空泡，細(xì)胞趨于老化。雖然這種方法原代培養(yǎng)操作簡便，細(xì)胞同源性好，但并非每塊組織都有生長能力，組織塊法原代培養(yǎng)成功率5%，培養(yǎng)的成活率較低，到可傳代的時間較長。

酶消化組織塊法，即將不經(jīng)切割的牙周膜先用酶消化使組織略松散，進(jìn)行培養(yǎng)。在實(shí)際操作中發(fā)現(xiàn)，從根中2/3刮取到的牙周組織塊已經(jīng)較小，為了最大限度地利用組織，減小損傷，將不經(jīng)切割的牙周膜直接用酶消化，以去除部分妨礙細(xì)胞生長的基質(zhì)和纖維［9］。此種方法雖然減少了牙周膜被反復(fù)剪切而導(dǎo)致組織塊的損傷，但刮取的過程中對牙周膜組織已經(jīng)造成了機(jī)械性損傷，組織塊成活率也較低，本實(shí)驗(yàn)成活率為10%。

利用全牙消化法可減少刮取組織塊時的機(jī)械損傷，最初消化下來的細(xì)胞為圓形，呈懸浮狀態(tài)。24h后圓形細(xì)胞開始貼壁，48h后幾乎全部貼壁。貼壁后的細(xì)胞伸展變形較慢，約貼壁后2～3d開始伸展變形，多數(shù)細(xì)胞形態(tài)呈長梭形或星形，少數(shù)呈扁平多角形。從第6天起，細(xì)胞生長加速，長梭形及星形細(xì)胞增殖活躍，多角形細(xì)胞生長相對較緩慢，細(xì)胞大約經(jīng)歷12d后開始形成單層，長梭形細(xì)胞占絕對優(yōu)勢。細(xì)胞傳至2～3代時可基本去除上皮樣細(xì)胞，4～10代細(xì)胞生長狀態(tài)較好，核分裂相多見，3～5d可長滿培養(yǎng)瓶底；本實(shí)驗(yàn)用此方法成功率20%。

3種方法培養(yǎng)的hPDL經(jīng)穩(wěn)定傳代后均為長梭形成纖維細(xì)胞，免疫組織化學(xué)實(shí)驗(yàn)顯示，細(xì)胞角蛋白染色陰性，波形絲蛋白染色陽性，說明傳代培養(yǎng)的細(xì)胞均來自中胚層的成纖維細(xì)胞。細(xì)胞經(jīng)穩(wěn)定傳代后，細(xì)胞的增殖速度相近，生長曲線很相似，說明細(xì)胞的生長特性無太大區(qū)別。通過對3種培養(yǎng)方法的比較發(fā)現(xiàn)，除細(xì)胞的初代培養(yǎng)時間和細(xì)胞純化程度3種方法差別較大之外，細(xì)胞的其他特性無明顯區(qū)別。實(shí)際應(yīng)用中，組織塊法培養(yǎng)hPDL適用于細(xì)胞純度要求較高的實(shí)驗(yàn)，而全牙消化法培養(yǎng)hPDL適用于短期內(nèi)獲得大量細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)；因本實(shí)驗(yàn)例數(shù)較少以及實(shí)驗(yàn)條件等原因，對體外培養(yǎng)hPDL的最佳實(shí)驗(yàn)方法仍需作進(jìn)一步的探索及改進(jìn)。