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作者：姜泓,王玲,張義和,劉世平,劉廣忠

【摘要】目的:建立新生大鼠缺氧缺血腦損傷(HIBD)模型,觀察新生鼠缺氧缺血后腦組織一氧化氮(NO)和NO合成酶(NOS)及神經元凋亡的變化及葛根素對HIBD的保護作用及機制.方法:用7日齡SD大鼠制備HIBD模型，治療組在缺氧缺血（HI）后早期腹腔注射葛根素50mg/kg兩次.在HI后不同時間測定腦組織勻漿NO和NOS含量以及神經元凋亡數量.結果:HIBD組在HI后24h腦組織NO，NOS明顯高于對照組(P<0.05)；HI后6h海馬CA1區凋亡細胞增多，24h達高峰；葛根素組24h腦組織NO，NOS較HIBD組相比，顯著下降(P<0.05)，同時海馬CA1區的凋亡細胞數在24h較HIBD組明顯減少(P<0.05).結論:葛根素可通過抑制NOS的表達，減少NO的過量生成，從而減輕HIBD后的神經元凋亡，表明葛根素對新生大鼠HIBD有保護作用.

【關鍵詞】葛根素;一氧化氮;一氧化氮合成酶;神經元凋亡;缺氧缺血;新生鼠

0引言

新生兒缺氧缺血性腦病（HIE）是新生兒期的常見病,是導致死亡和兒童神經系統傷殘的主要原因之一，目前尚缺乏特效治療方法.葛根素為豆科葛屬植物野葛干燥根中提取的異黃酮類的主要有效成分之一，在成人的腦血管疾病治療中療效顯著，但在HIE時的作用鮮見報道.本研究通過建立新生大鼠缺氧缺血模型，觀察大鼠腦缺氧缺血后腹腔內注射葛根素對腦組織NO和NOS含量及神經元凋亡的影響,以探討葛根素在HIE中的作用與機制.

1材料和方法

1．1材料新生7d齡SD大鼠48只，體質量12~16g，二級動物，雌雄不限，由第四軍醫大學實驗動物中心提供.葛根素注射液購自山東魯抗辰欣藥業有限公司，NO及NOS試劑盒購自南京建成生物工程研究所,原位細胞凋亡檢測試劑盒（德國ROCHE公司生產）購自北京中杉金橋生物技術有限公司，缺氧艙及氧濃度監測儀由第四軍醫大學航空醫學系提供.

1．2方法

1.2.1實驗動物分組將48只新生大鼠隨機分為3組：①葛根素治療組：于缺氧缺血后即刻、4h腹腔注射葛根素50mg/kg.②缺氧缺血性腦損傷組(HIBD)：于缺氧缺血后即刻、4h腹腔注射等量生理鹽水.③假手術對照組：僅作頸部切口，游離右側頸總動脈，但不結扎，于手術后即刻、4h腹腔注射等量生理鹽水.

1.2.2新生大鼠HIBD模型的建立以5g/L的氯胺酮麻醉，取仰臥位固定于手術板上.采取頸正中偏右2~3mm切口，游離右側頸總動脈，用50絲線結扎、縫合切口后，恢復2h置于2000mL常溫常壓缺氧艙，以1.5L/min的速度輸入含80mL/L氧氣和920mL/L氮氣的混合氣體，以測氧儀監控氧的濃度為(80±5)mL/L,2h后取出，返回母鼠身邊繼續哺乳喂養.

1.2.3腦組織標本的留取于腦缺氧缺血后6h,24h分別麻醉后斷頭取腦并矢狀離斷為左右半球.

1.2.4腦組織勻漿的制備及NO,NOS的檢測取部分右腦組織漂洗、去除血漬、稱重，按1∶9的比例加入冷生理鹽水，在玻璃勻漿管中充分研碎致勻漿化，取100mL/L腦組織勻漿3500r/min離心10min,取上清液檢測NO,NOS.具體操作按試劑盒說明.

1.2.4石蠟切片的制備及細胞凋亡檢測斷頭后，立即取出部分右腦組織置于中性甲醛（pH7.2~7.4的磷酸緩沖液PBS為溶劑的甲醛）中常溫固定24h，自丘腦中1／3平面行冠狀切片，厚約4mm，依次脫水、浸蠟、包埋，切片厚度約6μm,HE染色，光鏡下觀察確定海馬位置，臨近處的石蠟標本連續切片.切片放入65℃的烤片機上6h，取出后放入4℃冰箱待用.

原位缺口末端標記(TUNEL)染色細胞凋亡檢測：將組織切片依次脫蠟至水后，進行TUNEL染色，觀察400倍光鏡5個視野下平均陽性細胞數，具體操作步驟按試劑盒中的說明書進行（選用蛋白酶K通透處理）.

統計學處理:數據以x±s表示，兩組間比較采用LSDt檢驗.

2結果

2.1NO，NOS的變化HIBD在HI后6h腦勻漿NO,NOS水平開始升高，但與對照組相比無統計學意義（P>0.05）；24h腦勻漿NO，NOS水平明顯增高，與對照組相比差異顯著（P<0.05）；而葛根素治療組24h腦勻漿NO，NOS水平顯著低于HIBD，兩組相比，差異有統計學意義（P<0.05,表1）.

2.2HE染色和TUNEL染色假手術組在各個時間點腦組織切片無明顯缺氧缺血改變.HIBD組6h缺氧缺血側海馬組織輕度水腫，可見神經元腫脹、變性、空泡形成，核固縮，嗜堿性增強，核仁消失，并可見到凋亡小體；24h細胞凋亡達高峰，并見許多壞死細胞，嗜伊紅深染（圖1）.HIBD組各時間點其缺氧缺血側細胞核內均可觀察到凋亡細胞，凋亡細胞形態學特征為胞體縮小，細胞膜完整，染色質凝集，密度增高，呈塊狀或顆粒狀，胞核中有棕色顆粒.HIBD后6h其陽性細胞開始出現，24h最為明顯，呈小片樣分布.凋亡細胞多位于病變較重的皮質的邊緣內帶和海馬CA1區；而假手術對照組僅偶見到陽性細胞；葛根素治療組細胞凋亡的時程與HIBD組一致，分布極其相似，但海馬CA1區的凋亡細胞數在24h后各時間點較HIBD組均明顯減少（P<0.05，表2）.表1新生大鼠各組腦勻漿NO,NOS水平表2新生大鼠不同時間點右側大腦海馬CA1區凋亡細胞數

3討論

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sp;一氧化氮（NO）和內皮素（ET）是一對由血管內皮細胞分泌的血管舒張和收縮因子，其生物活性相互拮抗［1-2］.NO是一種具有自由基性質的氣體生物活性分子,大量研究表明，NO在腦缺氧缺血性損傷中具有神經保護和神經毒性的雙重作用，生理狀態下，NOS催化LArg和分子氧生成低水平固有型NO，作為內皮源性舒張因子具有舒張血管、抑制血小板聚集、防止血栓形成、拮抗氧自由基的作用；但HIBD后nNOS及iNOS被激活［3］,NO過度合成則可干擾與生物轉化有關的酶類的活性、破壞DNA結構、抑制線粒體的呼吸功能，具有明顯的神經毒性作用［4-5］.

葛根素是從中藥葛根中提取的一種異黃酮單體，其化學名為4，7二羥基8D葡萄糖基異黃酮.既往研究表明其具有多種藥理作用，包括：改善腦微循環，提高局部血流量，阻止Na+內流，具有Na+通道抑制劑的作用［6］；抑制鉀外流［7］；抗氧化［5］；拮抗興奮性氨基酸的神經毒性作用，減輕谷氨酸鈉、N甲基D天冬氨酸或卡因酸所介導的對鼠神經元的損害［7-8］，葛根素的多種藥理作用與HIBD發病機制相關.

本試驗通過新生鼠HI后腹腔內注射葛根素并測定腦組織NO和NOS含量及神經細胞凋亡變化,來探討葛根素在HIBD中神經保護作用的機制.結果表明HIBD組在HI后24h與對照組比較腦組織中NO,NOS明顯增高（P<0.05），同時缺氧缺血后海馬CA1區和額葉皮質可見較多凋亡細胞DN斷末端標記陽性信號，24h達高峰，表明腦缺氧缺血后，NOS被大量激活，使NO生成增加，而高水平的NO作為炎性細胞因子參與神經細胞損傷的過程.本研究表明,外源性給予葛根素可通過抑制NOS的表達而減少NO過量生成，從而減輕腦組織凋亡，對HIBD起到神經保護作用.

綜上所述，HI后給予葛根素治療可降低新生大鼠腦組織中的NO含量，對HIBD有一定的保護作用，為臨床治療新生兒HIE了理論依據.鑒于該藥在臨床應用的安全性,價格低廉，很有可能成為治療新生兒HIE的有效藥物之一.

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