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【摘要】目的確定川木通RAPD-PCR反應各因素的最佳水平，最終確定RAPD-PCR反應的最佳反應條件。方法采用正交設計L16（45）在4個水平上對川木通類植物進行RAPD-PCR進行試驗。兩次結果分別用統計軟件MINITAB進行分析。結果最終確定RAPD-PCR反應的最佳反應條件為：20μl體系，其中含1×CRbuffer,2.5mmol/LMgCl2,0.15mmol/LdNTPs,1.0UTaq酶，0.5μmol/L10-mer引物，50ng模板DNA，最終確定退火溫度36℃。同時發現Taq酶對反應體系影響最大。結論建立了可靠的反應體系，為該類藥材的分子鑒定奠定了基礎。

【關鍵詞】正交設計；川木通；RAPD-PCR

川木通類藥材均來自于毛茛科鐵線鏈屬植物，該屬植物我國共分布有108個種［1］，有些鐵線蓮屬藥用植物外形極為相似，有時非花期植株難以鑒別，經過藥材加工后更加難以辨別，容易在應用中造成品種混亂，影響臨床用藥安全與療效。因此，在具體開發使用本屬藥用植物資源時，應重視和加強對其品種的鑒定，以確保資源的正確合理使用。RAPD繼承了PCR技術效率高，樣品用量少（只需少量DNA樣品），靈敏度高，檢測容易等優點［2］，目前被廣泛地應用于藥用植物的分類鑒定工作。但PCR各因素水平對反應結果均有影響。目前關于川木通RAPD-PCR的反應體系優化未見報道，本實驗采用正交設計L16(45)在4個水平上對川木通類植物進行RAPD-PCR進行試驗，建立了較為可靠的反應體系。本工作為以后該類植物與藥材的分子鑒定奠定了基礎。

1材料

本實驗所使用的川木通原植物均為作者在四川各地實地采集，植物葉片采集后采用硅膠直接干燥，另外部分采集后直接編號用液氮保存，此后保存在-80℃冰箱備用，所采集植物均經過萬德光教授鑒定后備用。

Taq聚合酶、dNTP、T4連接酶、瓊脂糖購自TaKaRa寶生物工程（大連）有限公司；RAPD引物購自北京賽百盛公司。

2方法

2.1植物總DNA的小規模提取與DNA濃度的測定提取方法按干滟等［3］的方法并稍加改進。測定濃度后稀釋至50ng/μl。

2.2PCR反應因素水平的確定與正交表的設計［4］為了確定PCR反應中的5個因素（Taq酶、Mg2+、模板DNA、dNTP、引物）的最佳水平，采用正交設計L16(45)在4個水平上進行實驗。參加PCR反應的因素水平見表1，L16(45)設計方案見表2。表1PCR反應的因素水平μl水平（略）表2PCR反應的因素水平L16(45)正交實驗設計μl（略）

將表2的16個處理重復兩次，在PCR儀上進行擴增，結果電泳檢測，記錄。用統計軟件MINITAB進行分析，得到川木通RAPD-PCR反應各因素的最佳水平，最后在PCR儀上，用此最佳因素水平的PCR反應體系進行梯度退火試驗，篩選得到最佳退火溫度。

2.3RAPD擴增在正交結果的基礎上，建立了本實驗所使用的體系［5，6］。RAPD擴增反應所采用的條件和體系如下：20μl體系，其中含1×PCRbuffer，2.5mmol/LMgCl2，0.15mmol/LdNTPs，1.0UTaq酶，0.5μmol/L10-mer引物，50ng模板DNA，補ddH2O至終體積20μl。PCR反應熱循環程序如下：95℃預變性5min；36℃復性1min；72℃延伸1.5min；94℃變性1min；36℃復性1min；72℃延伸1.5min，35個循環。最后72℃延伸10min，反應產物在4℃保存。

2.4電泳分析與結果統計DNA擴增產物在1×TAE的緩沖條件下，于1.5%瓊脂糖凝膠分離，溴化乙錠染色。標準分子量為Tokara提供的DL2000Marker。使用凝膠成像系統（GDS8000，美國UVP）拍照分析。

3結果

3.1電泳結果評分按照表2設計的16個處理進行PCR反應后，產物進行電泳。結果見圖1。

根據電泳結果，按照本實驗目的，即以后將要進行的遺傳多樣性分析的要求將16個處理從高到低依次打分，條帶數量越豐富、清晰度越高、背景低的最佳產物記為16分，與此相反，最差的記為1分［7,8］。兩次重復分別獨立設計，從兩次重復的結果看，各個處理組合的反應都具有較高的一致性。兩次記分分別為1，13，14，11，10，16，15，12，2，9，8，7，6，5，4，3和1，12，14，13，10，16，11，15，2，8，9，7，5，6，4，3。

3.2各因素對PCR反應影響的差異分析將上述處理結果用統計軟件MINITAB(MinitabInc.)進行方差分析。結果見表3。由F值可見，Taq酶的影響最大，模板的影響最小，各因素對PCR反應的影響由大到小依次為：Taq酶、引物、Mg2+、dNTP、模板。由于各因素水平間的差異均達到顯著水平，可以進一步進行因素內多重分析。表3PCR反應各因素間方差分析（略）

3.3因素內各水平對PCR結果的影響為了分析各因素的最佳反應水平，在方差分析的基礎上，繼續對每個因素各個水平作多重比較，評價結果如下。

Taq酶的0.1與0.2，0.3與0.4水平差異不顯著，其余組合差異顯著。由于Taq酶對結果影響最大，0.3與0.4水平達到了反應的最佳效果，且水平間差異不明顯，從經濟角度考慮選擇了0.3水平為最佳反應水平。

Mg2+濃度對PCR結果影響明顯，較為敏感，2.5水平表現最好，選擇2.5水平作為本實驗的最佳反應水平。

模板DNA濃度在本實驗梯度內無明顯變化，本實驗選擇1作為標準。

dNTP濃度對PCR反應結果影響具有明顯的規律，在1～2水平上效果較好，其它高濃度效果較差。最終選擇dNTP最佳水平為2。

引物濃度最佳水平最終選擇1。

退火溫度進行梯度實驗后最終選擇36℃。

最終，RAPD-PCR反應的條件確定為：20μl體系，其中含1×PCRbuffer，2.5mmol/LMgCl2，0.15mmol/LdNTPs，1.0UTaq酶，0.5μmol/L10-mer引物，50ng模板DNA，補ddH2O至終體積20μl。PCR反應熱循環程序如下：95℃預變性5min；36℃復性1min；72℃延伸1.5min；94℃變性1min；36℃復性1min；72℃延伸1.5min，35個循環。最后72℃延伸10min，反應產物在4℃保存。

4討論

本實驗借助正交設計優化PCR反應體系，使結果較以往的單因素實驗更加科學、完善和簡便，為以后的分子鑒定工作的標準化、高重復性奠定了基礎。本方法在其它PCR類體系的設計優化上有一定的指導作用和示范意義。新晨：

【參考文獻】

1］中國科學院中國植物志編輯委員會.中國植物志(28卷)［M］.北京:科學出版社,1980:177.

［2］黎裕，賈繼增，王天宇.分子標記的種類及其發展［J］.生物技術通報,1999,4:19.

［3］干滟，曾凡亞，趙云，等.油菜單株總DNA的快速制備［J］.四川大學學報(自然科學版),1999,36(5):936.

［4］謝運海，夏德安，姜靜，等.利用正交設計優化水曲柳ISSR-PCR反應體系［J］.分子植物育種,2005,3(3):445.