前言：我們精心挑選了數篇優質檢測鑒定報告文章，供您閱讀參考。期待這些文章能為您帶來啟發，助您在寫作的道路上更上一層樓。

第1篇

（一）測量過程簡述

（1）測量依據：JJG 700—1999《氣相色譜儀檢定規程》。

（2）測量環境條件：溫度（15～25）℃，相對濕度40％～68％。

（3）測量標準：江蘇省計量科學研究院提供的標準物質。具體為氮中甲烷標準氣體。

（4）被量對象：氣相色譜儀。

（5）測量方法：氣相色譜儀（以下簡稱儀器）是在規定了儀器載氣流速穩定性、柱箱溫度穩定性、程序升溫穩定性的情況下，用微量注射器注入一定體積的標準物質，利用試樣中各組分在色譜柱中的氣相和固定相間的分配及吸附系數不同，由載氣把氣體試樣或汽化后的試樣帶入色譜柱中進行分離，并通過檢測器進行檢測的儀器。根據各組分的保留時間和響應值進行定性/定量分析。

（6）評定結果的使用：在符合上述條件下的測量結果，一般可參照使用本不確定度的評定方法。

（二）數學模型

火焰離子化檢測器（FID）

＝ (2)

式中：FID的檢測限（g/s）；

基線噪聲，（mV）；

標準物質的進樣量，（g）；

標準物質中溶質的峰面積，（mV·s）；

（三）各輸入量的標準不確定度分量的評定

對某臺氣相色譜儀檢測器為TCD的儀器，在室溫（25±1）℃的環境下進行檢定。

1標準物質的相對標準不確定度的評定

氮中甲烷標準氣體相對不確定度通常由標準物質證書給出，其定值不確定度為1.5％，包含因子＝2，則：

＝0.015/2＝0.0075

2微量注射器校準值的相對標準不確定度的評定

微量注射器的體積刻度是重要的不確定度來源之一，所以，微量注射器必須經校準后才能使用。根據上級校準證書中給出的測量不確定度為0.5%，k=2,則

＝0.005/2＝0.0025

3 峰面積測量值的相對標準不確定度的評定

峰面積或峰高測量不確定度主要為進樣的進樣的重復性，規程規定進樣6次,定量重復性為不大于3%，則：

＝0.03/＝0.0122

4基線噪聲測量的相對標準不確定度的評定

對于工作站而言，基線噪聲引起的一般為0.01。

（四）合成標準不確定度及擴展不確定度的評定

1靈敏系數

數學模型： ＝

靈敏系數： ＝1 ＝1＝－1

2各不確定度分量匯總及計算表

各不確定度分量匯總及計算表

5擴展不確定度的評定

第2篇

[關鍵詞]果蠅S2細胞；熒光素酶；啟動子；報告基因；轉染

在研究基因功能的過程中，不可避免地要研究基因的調控機制，而基因的表達產物復雜且難以對其定量和定性，要在細胞生長周期的任意點了解細胞的基因表達產物更是非常困難。但報告基因分析系統的發現給基因調控與表達的研究帶來了新的希望。近年來，報告基因系統的研究取得了快速的發展。報告基因是一種編碼某種易于檢測蛋白質或酶的基因，通過它的表達產物來標定目的基因的表達調控，因此，對真核基因調控的了解可以不通過直接測定調控元件調節轉錄速率的能力，而是把順式調控元件與報告基因的序列連接起來，在基因轉錄的過程中測定報告基因轉錄產物的表達量，從而判斷相應的順式作用元件的調控能力。作為報告基因必須具備以下特點：（1）由原核基因編碼的基因產物必須區別于轉染前真核細胞內任何相似的產物；（2）細胞內其他基因產物不會干擾報告基因產物的檢測；（3）報告基因編碼產物的檢測應該快速、簡便、靈敏度高、重復性好。該技術的主要優點是靈敏度高、可信性大及檢測方便且適合大規模檢測，目前已廣泛應用于啟動子分析、監控轉基因及其表達、細胞的信號轉導與藥物的篩選等多種細胞事件[13]。熒光素酶（LUC）報告基因來源于北美螢火蟲，能催化螢火蟲的氧化性羧化作用，同時發射出光子，可被光度計捕獲定量。LUC的分析具有快速、方便、線性較好等優點，正成為最廣泛使用的報告基因。pGL3系列的質粒就是帶有LUC報告基因的質粒載體，我們可以利用這一系列的工具載體研究果蠅中基因的表達調控方式，其中pGL3Control帶有SV40的啟動子和增強子。SV40是一種猴病毒， 它的增強子/啟動子區域可使其在大多數細胞株中有高度的組成性表達，因而廣泛用于構建真核基因的表達載體，因此pGL3Control可作為檢測體系中的陽性對照。但由于SV40啟動子在果蠅S2細胞中不表達，所以我們將果蠅actin 5C 蛋白的啟動子（pac）[4]構建到質粒pGL3Basic中，得到了高表達LUC的重組載體pGL3pac。這一質粒的構建可為研究果蠅中基因的調控方式奠定基礎，同時也可為研究其他報告基因在不同細胞中的表達提供借鑒作用。

1 材料和方法

1.1 菌株、質粒及試劑大腸桿菌DH5α（作者所在實驗室保存），質粒pGL3Basic(Promega公司)，pAc5.1/V5His/LacZ(Invitrogen公司)，限制性內切酶XhoⅠ、HindⅢ及T4連接酶、DNA聚合酶(TaKaRa公司)，小量膠回收試劑盒(TaKaRa公司)，中量質粒抽提試劑盒(Invitrogen公司)，LUC檢測試劑盒(Promega公司)，S2細胞Schneider培養基(Invitrogen公司)，胎牛血清（Gibco公司）。

12 方法

1.2.1 pac啟動子的獲得 以pAc5.1/V5His/LacZ質粒為模板進行PCR擴增。上游引物5′GCGCCTCGAGCTTCAAGGAATTAATTCTATATTCT3′，下游引物5′GCGCAAGCTTGGTCTCTGGATTAGACGACT3′（劃線部分分別為XhoⅠ和HindⅢ酶切位點）。PCR反應參數為：95 ℃ 5 min；94 ℃ 1 min，60 ℃ 1 min，72 ℃ 2 min，共30個循環； 72 ℃延伸10 min。

1.2.2 重組質粒的構建鑒定與中量抽提純化 PCR產物分別經XhoⅠ、HindⅢ雙酶切后進行瓊脂糖凝膠電泳，割膠回收酶切片段，與同樣經酶切、割膠回收的pGL3Basic質粒于16 ℃連接過夜，連接產物轉化大腸桿菌DH5α，并涂布于含氨芐青霉素（終質量濃度為50 mg?L-1）的固體培養基上，37 ℃過夜培養。挑陽性克隆提取質粒，酶切和測序鑒定，鑒定正確的質粒經中量質粒抽提試劑盒提取純化。

1.2.3 S2細胞培養及瞬時轉染 S2細胞由本實驗室凍存，使用Schneider培養基，補以10%胎牛血清。S2細胞培養在28 ℃無CO2培養箱中，根據其生長狀態，按一定比例每3 d傳代1次。待細胞生長狀態良好時進行瞬時轉染分析。轉染時在12孔板中接種1×106個細胞，加入1 ml含10%胎牛血清的Schneider培養基，置28 ℃無CO2培養箱中培養6～16 h[細胞生長至對數生長期達（2～4）×106ml-1]，在1.5 ml Eppendorf 管中準備以下試劑：溶液A，12 μl 2 mol?L-1 CaCl2，5 μg重組質粒，1 μg pAcLacZ質粒，加入雙蒸水至總體積為100 μl，混勻待用；溶液B，100 μl2×HBS。將A溶液緩慢加入B溶液中，輕輕混勻，室溫放置30 min，以形成Ca3PO4DNA復合物。將Ca3PO4DNA復合物逐滴加至細胞上，混勻后置28 ℃無CO2培養箱中繼續培養，24 h后用含10%胎牛血清的Schneider培養基給細胞換液。細胞轉染48 h后裂解細胞，先吸去培養液，用PBS洗2遍，在每個培養孔中加入200 μl Reporter lysis buffer，保證充分覆蓋細胞，凍融1次以確保細胞裂解，將細胞裂解液移至1.5 ml Eppendorf管中，振蕩10～15 s，離心（12 000×g，2 min，4 ℃），轉移上清于新管。制備好的細胞裂解液可用于測定或貯存于-70 ℃備用。

1.2.4 LUC和β半乳糖苷酶(βgal)活性測定 取制備好的細胞裂解液進行LUC和βgal活性的測定。LUC活性測定前取20 μl平衡至室溫的細胞裂解液，加入80 μl LUC底物，迅速混勻，置光度計中，記錄讀數。βgal活性測定根據分子克隆的方法，在每個用于測定轉染細胞裂解物的Eppendorf管中加入100×Mg2+ 3 μl、1×ONPG 66 μl、細胞裂解物30 μl、0.1 mol?L-1Na3PO4 201 μl，混勻。置37 ℃保溫30 min，以500 μl 1 mol?L-1 Na2CO3終止顯色反應。置酶標儀上，在波長420 nm處讀光吸收值來表示βgal的活性，以共轉化的βgal活性作為內源對照，以/βgal活性的值為系數，比較各組在轉化效率相同時LUC活性的相互關系。以沒有任何插入片段時pGL3Basic的LUC活性為1，比較加上插入片段pac啟動子后的LUC活性增加的倍數，即LUC的相對活性，以反映LUC基因表達的相對水平。

2 結

果

2.1 重組載體的構建鑒定與純化以pAc5.1/V5His/LacZ質粒為模板，通過上游引物和下游引物PCR擴增獲得pac啟動子2 500 bp基因片段（圖1），用XhoⅠ、HindⅢ雙酶切后克隆到載體pGL3Basic中（圖2）。提取重組陽性質粒，XhoⅠ、HindⅢ雙酶切后得到2 500 bp的基因片段（圖1）。經測序鑒定，閱讀框架不變。鑒定完成的重組質粒經過質粒中量抽提試劑盒提取純化，得到符合轉染所需的高純度高濃度的重組質粒pGL3pac，經測定其260 nm的OD值，計算得到其濃度為0.99 μg?μl-1，A260 nm/A280 nm為1.81。

2.2 S2細胞的瞬時轉染分析轉染結果顯示，pGL3Basic和pGL3Control中LUC的相對活性無明顯差異，提示SV40啟動子在果蠅S2細胞中不表達或低表達。而pGL3pac中插入了pac啟動子，LUC的相對活性明顯增高。pGL3pac在果蠅S2細胞中LUC的活性是pGL3Basic LUC活性的近2.7萬倍。見表1。表1 瞬時轉染后各組分酶活性值

3 討

論

LUC是現在常用的一種報告基因，因其無放射性、檢測快、靈敏度高、半衰期短、線性好等特點而得到廣泛的應用。我們構建了pGL3pac這一重組質粒，使得在果蠅S2細胞中能夠高表達LUC，為進一步的實驗提供了一個好的工具。首先，它可作為基因啟動子分析研究中的陽性對照，通過與該重組質粒的轉染結果比較，從而判定不同順式作用元件對轉錄的影響。其次，我們可以將目的基因某一區域的啟動子元件插入到重組質粒pGL3pac啟動子的上游或下游，通過LUC表達量改變的放大作用，進一步分析這些啟動子元件的生物學作用，找到在轉錄過程中起到關鍵作用的核心啟動子序列。在此基礎上，我們還可以了解特定的反式作用因子對基因表達的影響。再次，還可以將目的基因自身的5′端或3′端的UTR序列插入到LUC基因的上下游，通過檢測LUC的水平，為翻譯水平的調控提供依據。在實驗過程中，有很多方面值得我們注意。第一，在重組質粒利用中量試劑盒抽提純化時，想得到濃度高的產物，應注意在菌液的培養量和培養時間上進行調整。因實際環境的不同，按照操作說明所示的條件往往難以得到足夠的質粒量，通過增加培養的菌液量和延長培養時間可取得很好的效果。由于所得的質粒是細胞轉染所需，故在抽提純化時應特別強調無菌的原則。第二，在轉染實驗中，重組質粒pGL3pac必須共同轉染表達另外一帶有報告基因的質粒以衡量轉染效率。我們選擇了pAcLacZ，該質粒含lacZ基因，能夠表達βgal，利用βgal水解底物ONPG的能力計算出βgal的活性，以此作為內源對照衡量不同組分的轉染效率。這個質粒與目的質粒的轉染比例對于結果有很大的影響。因βgal的活性在0.2～0.8之間符合線性范圍，所以可根據這一要求摸索合適的轉染比例，通過實驗可得出兩者在5∶1濃度比時較合適。另外，還可以選擇帶有其它報告基因的質粒載體，如phRL是一種帶有海腎熒光素酶（RLUC）報告基因的質粒載體，如果選擇phRL作為共轉質粒則可通過在一管細胞裂解液中先后加入不同的底物，用同種儀器測定酶的活性即可，因其測定的兩種酶的活性在同一數量級而且減少實驗步驟，使實驗數據更加可靠，實驗過程更加簡便[5]。第三，我們是通過瞬時轉染得出結論，為排除一些因素的影響，轉染實驗必須重復3或4次，本實驗的轉染數據即是3次實驗的平均值。在實驗中我們選擇了pac替代pGL3Control中的SV40啟動子，主要是因為果蠅actin 5C蛋白組在果蠅體內為組成性表達且不需誘導，因此，利用pac作為替換啟動子，不僅能產生較好的效果而且可簡化實驗操作。這一質粒的構建不僅為我們在細胞水平利用報告基因系統研究果蠅中基因的表達調控方式提供工具載體，而且它的構建方法提示我們可通過相同的途徑構建適合轉染不同類型細胞的帶有報告基因的質粒載體，作為相應研究的基礎。

[參考文獻]

[1]LOUISE H. Reporter gene technology：the future looks bright [J].Biochem Pharmacol，1999，58:749757.

[2]GAMBHIR S S，BARRIO J R，HERSCHMAN H R，et al. Assays for noninvasive imaging of reporter gene expression [J]. Nucl Med Biol，1999，26：481490.

[3]LECLERC G M，BOOCKFOR F R，FAUGHT W J，et al.Development of a destabilized firefly luciferase enzyme for measurement of gene expression [J].Biotechniques，2000，29:590596.

第3篇

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圖1

接下來將百寶箱加載進來。為了便于加載宏，我們將按鈕放到快速啟動欄上。在左上角的快速啟動欄上右擊鼠標，選擇“自定義快速訪問工具欄”，選擇“不在功能區的命令”，在下邊的列表中找到“加載宏”，點擊“添加”將其加入到右邊列表中，確定，就將“加載宏”圖標放到了快速啟動工具欄上。點擊快速啟動欄上的“加載宏”按鈕，定位到剛才解壓出來的“百寶箱”文件夾中的加載宏文件，確定，Excel 2007的菜單欄就多出一個“百寶箱”的選項卡，里面有“基礎強化工具”、“圖標工具箱”、“一鍵工具箱”以及“系統工具箱”等選項組，很多小工具等著來幫你（見圖2、圖3）。

圖2

圖3

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