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《現(xiàn)代食品科技雜志》2014年第七期

1材料與方法

1.1Yt瘤內(nèi)注射對H22荷瘤小鼠的抑制腫瘤生長實驗BALB/c小鼠（雌雄各半，6周齡，16~18g）購自湖北省動物中心，并按照實驗動物管理條例飼養(yǎng)在湖北省動物中心屏障系統(tǒng)中。由腹水小鼠抽取H22腹水，用生理鹽水洗滌并重懸計數(shù)，以濃度為5×105個/mL皮下接種100μL于小鼠右前腿腋下，6~7d皮下有可觸腫瘤塊的形成說明模型構(gòu)建成功。腫瘤細胞接種第四天，藥物Yt按照5mg/kg動物體重的劑量通過瘤內(nèi)注射使用，隔天注射16次，并記錄腫瘤生長情況，測量腫瘤最大直徑和最小直徑，按照腫瘤體積=1/2L1L22（L1為最大直徑，L2為最小直徑）來計算。

1.2瘤內(nèi)注射Yt產(chǎn)生抗體檢測2.5mg/kg動物體重劑量的Yp和Ys按照Yt的注射方法進行，在BALB/c小鼠完成瘤內(nèi)注射Yt、Yp、Ys治療后，眼球采血，室溫放置1h，置于4℃過夜。4000r/min離心10min，取上清用ELISA方法檢測Yt、Yp、Ys抗體的產(chǎn)生。分別將20μg/mLYt、Yp、Ys包被在ELISA板上，4℃放置過夜。甩掉上清，室溫下PBST（0.05%吐溫）洗板5次，每次4min。3%BSA（溶于PBST）每孔200μL37℃封閉1h。室溫下PBST（0.05%吐溫）洗板5次，每次4min。加入檢測血清。陰性對照包括：底物+終止劑；包被Yt、Yp、Ys+二抗+底物+終止劑；包被Yt、Yp、Ys+底物+終止劑。陽性對照為：20μg/mLYt包被+倍比稀釋的AAL（Agrocybeaegeritalectin）-抗體（1:500，1:1000，1:2000，1:4000，1:8000，1:16000，1:32000，1:64000），實驗組：倍比稀釋的Yt治療組動物血清（1:500，1:1000，1:2000，1:4000，1:8000，1:16000，1:32000，1:64000），倍比稀釋的Yp，Ys治療組動物血清（1:500，1:1000，1:2000，1:4000，1:8000，1:16000，1:32000，1:64000）。去除一抗，室溫下PBST（0.05%吐溫）洗板5次，每次4min。二抗1:4000037℃溫浴1h。室溫下PBST（0.05%吐溫）洗板5次，每次4min。TMB顯色5~20min，0.5mol/L硫酸終止反應(yīng)。使用酶標(biāo)儀測定450nm處OD值。

1.3Yt瘤內(nèi)注射對荷H22的BALB/c小鼠的免疫記憶功能選擇Yt治療后腫瘤消退的小鼠，使用周齡相同的正常小鼠作為對照，兩周后原位再次接種H22（1×106個/mL），觀察小鼠腫瘤生長狀況。

1.4小鼠血清細胞因子的表達水平檢測瘤內(nèi)注射Yt（5mg/kg）的BALB/c小鼠，在注射完成后，眼球采血，室溫放置1h，置于4℃過夜。4000r/min離心10min，取上清用博士德IL-2，TNF-αELISA檢測試劑盒檢測血清中細胞因子IL-2，TNF-α的含量，使用IL-2，TNF-α的標(biāo)準(zhǔn)品倍比稀釋作出標(biāo)準(zhǔn)曲線。1.6統(tǒng)計學(xué)方法應(yīng)用統(tǒng)計軟件SigmaStat3.5版本進行數(shù)據(jù)分析，首先進行標(biāo)準(zhǔn)化分析并轉(zhuǎn)化以符合正態(tài)分布要求。腫瘤組織大小比較通過one-wayANOVA結(jié)合Tukeyposthoctests分析。數(shù)據(jù)均使用平均值±SD表示，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2結(jié)果與討論

2.1Yt在荷瘤小鼠模型中的抗腫瘤活性在之前研究中，我們發(fā)現(xiàn)從茶樹菇中提取的活性蛋白組分Yt，無論是在腫瘤細胞系還是荷瘤小鼠模型上，都表現(xiàn)出顯著的抗腫瘤活性，且其抗腫瘤活性與免疫系統(tǒng)密切相關(guān)（裸鼠模型中抗腫瘤活性部分喪失）[5]。因此希望通過進一步研究，探討活性蛋白組分Yt對荷瘤小鼠的免疫調(diào)節(jié)功能。腫瘤大小統(tǒng)計數(shù)據(jù)顯示（圖1），實驗組與對照組小鼠腫瘤大小顯著不同，小鼠腫瘤組織的生長得到明顯抑制，尤其是在第27、29、31、33、35、37d，10只小鼠接種位置腫瘤組織完全消退。上述數(shù)據(jù)說明Yt在荷H22的小鼠模型中表現(xiàn)出顯著的抑制腫瘤活性，這與之前的研究結(jié)果是一致的。而Yt的分離組分蛋白質(zhì)Yp和小分子組分Ys，二者仍具顯著的抗腫瘤活性，但都弱于總組分Yt[6]，這說明Yt的抗腫瘤活性是通過兩種組分作用的累加。

2.2荷瘤小鼠瘤內(nèi)注射Yt產(chǎn)生抗體檢測由于Yt組分主要是蛋白質(zhì)Yp和小分子化合物Ys[6]，蛋白質(zhì)組分可能會使機體產(chǎn)生大量抗體從而具有毒性，因此我們使用ELISA方法檢測Yt治療小鼠（5mg/kg）血清抗體產(chǎn)生情況及蛋白質(zhì)組分Yp、小分子組分Ys（2.5mg/kg）治療小鼠后血清抗體產(chǎn)生情況，結(jié)果見表1。以AAL（Yt的主要成分之一）的抗體為陽性對照，結(jié)果表明，當(dāng)AAL抗體在低濃度下（1:64000），仍然可以檢測到陽性信號。Yt治療組動物血清在高濃度下（1:500），信號依然很弱。其中小分子組分Ys治療組小鼠血清在高濃度（1:500）下，陽性信號很弱，這與小分子物質(zhì)不易引發(fā)動物機體免疫反應(yīng)有關(guān)，而蛋白組分Yp引發(fā)機體抗體血清滴度很低，這可能與蛋白組分含量較高，高頻注射產(chǎn)生高區(qū)帶耐受有關(guān)。也說明了Yt、Yp、Ys瘤內(nèi)注射不會因引發(fā)機體產(chǎn)生大量抗體而帶來毒性。蛋白質(zhì)/多肽由于其容易在胃腸道及血液中被降解，或者容易產(chǎn)生抗體，在傳統(tǒng)觀點中通常不作為藥物開發(fā)的候選分子，這也是藥用真菌中蛋白質(zhì)活性成分被忽略的重要原因之一。然而，近些年來，越來越多的蛋白/多肽被開發(fā)成藥物，蛋白/多肽藥物也因其高親和性，高特異性，低毒性的特點，逐漸成為現(xiàn)代醫(yī)藥的重要組成部分。例如，豚鼠血清來源的L-天冬酰胺酶，由于腫瘤細胞的生長比正常細胞需要更大量的天冬酰胺，因此使用天冬酰胺酶降解天冬酰胺，從而特異性抑制腫瘤細胞的生長，L-天冬酰胺酶已成為治療白血病的常用藥物[7]。2005年通過批準(zhǔn)的艾塞那肽Exenatide是從大毒蜥唾液中提取的一種多肽類藥物，用于治療II型糖尿病[8]。雖然有許多蛋白/多肽從真菌中分離純化出來，但報道具有活性的仍是少數(shù)。我們研究發(fā)現(xiàn)，藥用真菌中蛋白/多肽組分具有很強的抗腫瘤和延長小鼠生存期的活性，且毒性較小，表明其作為抗腫瘤候選藥物的潛力。

2.3Yt抗腫瘤效應(yīng)的免疫記憶作用Yt在BALB/c小鼠及裸鼠模型中表現(xiàn)出不同的抗腫瘤活性，且通過刺激小鼠的免疫系統(tǒng)來發(fā)揮活性[5]。我們進一步檢測這種免疫活性是否具有記憶性。瘤內(nèi)注射Yt（5mg/kg）16次，選擇腫瘤消退的小鼠，兩周后原位再次接種H22（1×106個/mL，為建腫瘤模型的10倍），同時使用相同周齡的小鼠做對照。從表2可以看出，對照組小鼠腫瘤正常生長，Yt治療且腫瘤消退的小鼠再次接種H22腫瘤細胞，到第三周都未見腫瘤生長。這說明Yt處理后小鼠的免疫反應(yīng)具有記憶性，可保護小鼠不長腫瘤。腫瘤治療的臨床難題之一即手術(shù)后的復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移，因此好的治療型腫瘤疫苗除了可消退腫瘤或抑制腫瘤轉(zhuǎn)移，更重要的是具有預(yù)防保護作用[9]。很多臨床試驗研究發(fā)現(xiàn)，單獨使用腫瘤細胞的免疫源性會比較弱，因為很多腫瘤抗原是機體耐受的。在20世紀(jì)70年代，人們發(fā)現(xiàn)注射活的BacilleCalmette-Guerin（BCG）可以使轉(zhuǎn)移性黑素瘤病人腫瘤縮小，從而推測非特異性的免疫激活可以幫助刺激腫瘤特異性免疫反應(yīng)[10]。因此近年來，多使用佐劑包括BCG，CorynebacteriumParvum，DETOX，鋁鹽來提高疫苗免疫激活的作用。國內(nèi)研究者也有使用天然提取物作為佐劑[11]。Yt治療的小鼠可獲得免疫記憶能力，暗示了茶樹菇活性蛋白組分作為腫瘤疫苗佐劑的潛力。

2.4瘤內(nèi)注射Yt對荷瘤小鼠血清細胞因子蛋白表達水平的影響細胞因子的表達與免疫調(diào)節(jié)及維持免疫記憶的能力有密切關(guān)系[12]，因此使用ELISA檢測荷H22小鼠瘤內(nèi)注射vehicle和Yt（5mg/kg）后，血清中IL-2和TNF-α的蛋白表達水平。如圖2所示，血清中IL-2表達水平在對照組小鼠中為38.9±27.59pg/mL，Yt治療組為84.6±37.6pg/mL，提高到對照組的2.17倍（p<0.05）。而TNF-α在對照組和治療組分別為188.4±91.3和200.3±52.2pg/mL，沒有顯著性差異（p>0.05）。大型真菌中提取的活性組分大多以免疫調(diào)節(jié)為作用方式，通過調(diào)節(jié)細胞因子的分泌來增強天然免疫系統(tǒng)和細胞免疫反應(yīng)。例如，從Volvariellavolcacea分離的蛋白Fip-wo可上調(diào)小鼠IL-2、IL-4、IFN-γTNA-α的mRNA表達水平[13]。從Grifolafrondosa分離的低分子量蛋白組分MLP可誘導(dǎo)結(jié)腸癌小鼠脾臟IL-12和IFN-γ的表達[14]。之前的研究表明，瘤內(nèi)注射Yt可上調(diào)Th1型細胞因子（IL-2，IFN-γ，TNF-α），下調(diào)Th-2型細胞因子（TGF-β）mRNA的表達[5]。蛋白組分Yp可上調(diào)Th2型細胞因子IL-10的mRNA表達，與Fip[13]、MLP[14]不同[6]；小分子量Ys可上調(diào)GM-CSF和TGF-β的mRNA表達[6]。本文發(fā)現(xiàn)Yt可上調(diào)血清IL-2的表達，與之前的Yt誘導(dǎo)脾臟IL-2的mRNA表達數(shù)據(jù)一致。Yp和Ys分別通過調(diào)節(jié)不同的細胞因子產(chǎn)生來發(fā)揮抗腫瘤活性，主要由Yp和Ys組成的Yt則通過同時調(diào)節(jié)Th1型和Th型免疫應(yīng)答來發(fā)揮功能。另外，有報道表明細胞因子IL-2、GM-CSF可以提高腫瘤疫苗的抑制腫瘤活性及免疫保護活性[15]，瘤內(nèi)注射Yt顯著抑制腫瘤生長的活性及免疫記憶功能有可能與其上調(diào)細胞因子IL-2有關(guān)。

3結(jié)論

基于對Yt抗腫瘤活性的研究，說明大型真菌活性蛋白質(zhì)組分是除多糖之外另一重要活性成分，值得深入研究。本文檢測了Yt治療荷瘤小鼠后，并不誘導(dǎo)機體產(chǎn)生大量抗體；且可誘導(dǎo)機體產(chǎn)生抗腫瘤免疫記憶功能，保護小鼠再次接種腫瘤細胞時不長腫瘤；另外Yt注射可上調(diào)小鼠血清細胞因子IL-2的表達。該數(shù)據(jù)表明，Yt通過調(diào)節(jié)機體免疫系統(tǒng)功能，發(fā)揮其顯著的抗腫瘤活性。進一步分離鑒定Yt中的有效組分，將有助于闡明Yt免疫調(diào)節(jié)功能，并為大型真菌有效活性組分及應(yīng)用提供理論數(shù)據(jù)。

作者：梁一郭蓮仙孫慧單位：廣東醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)檢驗學(xué)院武漢大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院病毒學(xué)國家重點實驗室