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《茶葉科學(xué)雜志》2016年第二期

摘要：

采用RACE技術(shù)，獲得茶樹武夷奇種C18葉片花青素合成途徑中的花青素合成酶（ANS）基因的cDNA全長序列。采用染色體步移技術(shù)獲得該基因的啟動子序列。采用實時熒光定量PCR技術(shù)檢測該基因在不同遮光處理下的表達動態(tài)。結(jié)果表明，csans全長cDNA為1000bp，其中ORF（OpenReadingFrame）為957bp，編碼320個氨基酸，含有DIOX-N和20G-Fell-Oxy保守功能結(jié)構(gòu)域；分離得到CsANS基因上游調(diào)控序列1010bp，其含啟動子核心元件TATA-box及ACE、GT1-motif、Sp1（光響應(yīng)元件）、circadian（生物鐘相關(guān)元件）等與花青素合成途徑相關(guān)的重要順式作用元件。熒光定量PCR分析表明，該基因在全光照處理（CK）時表達量較高，75%遮光時表達量較低。說明該基因的表達受光照強弱的控制。

關(guān)鍵詞：

茶樹；CsANS基因；啟動子；生物信息學(xué)分析

茶樹武夷奇種C18，無性系。灌木型，中葉類，中生種。是福建省武夷山市茶葉研究所從武夷群體種中選育的優(yōu)良品系。芽葉紫紅色，茸毛較密，節(jié)稍長。且芽葉生育力強，發(fā)芽較密，持嫩性較強，是一種稀有的特色茶樹資源。武夷奇種C18芽葉呈現(xiàn)紅紫色，花青素含量較高[1-2]。研究表明，花青素是茶樹葉片呈現(xiàn)“紅紫色”的主要原因[3]。植物花青素的生物合成途徑已有較為深入的研究，其中花青素合成酶（Anthocyaninsynthase，ANS）是將無色花青素經(jīng)氧化脫水形成紅紫色花青素的關(guān)鍵酶[1]。環(huán)境信號激活花青素合成途徑中相關(guān)基因的表達[4]。在花青素合成的前期，光能調(diào)控相關(guān)基因的表達，弱光可以抑制或下調(diào)基因的表達，從而減少花青素的合成；而強光可以誘導(dǎo)花青素合成相關(guān)基因的表達，使花青素的含量增加[5]。光信號調(diào)控轉(zhuǎn)錄因子與啟動子結(jié)合的強弱，并影響結(jié)構(gòu)基因的表達，其表達量也會隨之發(fā)生相應(yīng)的變化[1]。目前在茶樹上，ANS基因的啟動子還未克隆。本研究根據(jù)已有的茶樹ANS基因的EST（Expressedsequencetags）序列，采用同源克隆和GenomeWalking方法，克隆了紫葉茶樹的ANS基因及分離5′調(diào)控序列，再利用生物信息學(xué)法，預(yù)測了啟動子的順式作用元件，采用熒光定量PCR技術(shù)，分析ANS在不同光照條件下的表達模式，有助于揭示ANS在紫色茶樹葉片對環(huán)境信號響應(yīng)過程中的作用，解析光強對武夷奇種C18ANS基因的調(diào)控機理，為紫芽茶樹特異種質(zhì)的創(chuàng)制和利用提供理論依據(jù)。

1材料與方法

1.1材料與處理1.1.1植物材料試驗材料為武夷奇種C18，由福建省武夷山市茶葉研究所資源圃提供。選取武夷奇種C18的成熟葉片，迅速用液氮處理，置－80℃冰箱保存,用于基因組DNA的提取，克隆CsANS啟動子序列。

1.1.2遮光處理試驗在福建省武夷山市茶葉研究所資源圃中完成。2015年4月中旬，挑選生長發(fā)育良好、整齊一致、樹形基本相似的植株27株，分為3組（每9株為1組，每重復(fù)3株），掛牌標(biāo)記，并對其進行同一高度的修剪。待茶樹芽頭萌動之時，開始遮光處理。設(shè)2個處理：分別用75%和60%的黑色遮蔭網(wǎng)遮光，以全光照處理為對照。經(jīng)過15d的遮光處理，取經(jīng)遮光處理和全光照處理（CK）的武夷奇種C18葉片（第一葉位），經(jīng)錫箔紙分裝于－80℃保存，用于熒光定量PCR檢測。

1.1.3試劑FHPlantDNAKit(北京德曼特爾生物科技有限公司)；PrimerStar(TaKaRa公司)；AgaroSeGelDNAExtractionKit(TaKaRa公司)；SMARTerRACE5′/3′Kit(TaKaRa公司)；染色體步移試劑盒(TaKaRa公司)；pEASY-BluntZeroCloningKit(福州都拜特生物技術(shù)有限公司)；引物合成及樣品測序由鉑尚生物技術(shù)（上海）有限公司完成。

1.2方法

1.2.1茶樹葉片總RNA及基因組DNA的提取本試驗參照多糖多酚植物總RNA提取試劑盒[天根生化科技（北京）有限公司]提取茶樹總RNA；采用FHPlantDNAKit(北京德曼特爾生物科技有限公司)試劑盒提取紫葉茶樹基因組DNA。

1.2.2茶樹CsANS5′RACE、3′RACE及全長ORF的PCR擴增cDNA第一鏈的合成按RevertAidTMFirst-StrandcDNASynthesisKi試劑盒說明書進行。根據(jù)已報道的擬南芥、葡萄、茶樹等ANS基因序列，用DNAMAN設(shè)計同源克隆引物。上游引物：5′-CAACAATGATGACTACAGTGGCTG-3′，下游引物：5′-GCGCCTTTAGAGCCAAGTTCTTG-3′。PCR擴增體系：12.5µLEx-Taqmix，2µLcDNA模板，0.5µLANS-R，0.5µLANS-F，補ddH2O至25µL體系。94℃預(yù)變性4min，94℃變性40s，56℃退火30s，72℃延伸3min，35個循環(huán)，最后72℃延伸10min進行PCR擴增。在其ORF兩端設(shè)計特異引物qANS-R：5′-ATGGCTCTCTGTACATATGCATGTC-3′；qANS-F：5′-TTATACAATTGTTACACCCCCGGTC-3′擴增全長序列。

1.2.3CsANS基因啟動子的克隆根據(jù)TaKaRaGenomeWalkingKit引物設(shè)計原則，在已知的茶樹ANS基因（GenBank收錄號為AY830416.1）的已知序列區(qū)（最好不少于500bp）分別設(shè)計3條反向且退火溫度較高的特異性引物SP1、SP2和SP3，再與試劑盒中提供的4種經(jīng)過獨特設(shè)計的退火溫度較低的兼并引物AP1、AP2、AP3和AP4進行熱不對稱PCR反應(yīng)[6]，經(jīng)過3次巢式PCR反應(yīng)獲得已知序列的側(cè)翼序列。用于擴增ANS基因啟動子序列的特異性引物情況詳見表1。以提取的武夷奇種C18茶樹葉片DNA為模板，按照TaKaRaGenomeWalkingKit說明和林玉玲等[7]的方法進行ANS基因啟動子的克隆。PCR產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳后，切下目的條帶克隆至pMD18-T載體，37℃連接過夜后進行轉(zhuǎn)化測序（鉑尚生物技術(shù)有限公司）。

1.2.4熒光定量PCR表達分析分別提取遮光75%、60%和全光照處理（CK）的武夷奇種C18第一葉位總RNA，用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（TaKaRa）反轉(zhuǎn)錄成cDNA，稀釋10倍作模板。以18S-rRNA基因為內(nèi)參（18SⅠ：5′-CCTGAGAAACGGCTACCACA-3′，18SⅡ：5′-CACCAGACTTGCCCTCCA-3′）。運用DNAMAN軟件，按照熒光定量PCR引物設(shè)計原則，設(shè)計熒光定量PCR引物（ANS-R：5′-GTTGCTGTAATAGGCGATGGTG-3′，ANS-F：5′-CCTGTTGGACTGTAATCTGCTAAG-3′）。參照SYBRPrimeScriptTMRT-PCRKit（TaKaRa）說明書，進行熒光定量PCR擴增體系：cDNA模板1µL，2×SYBRPremixEx-TaqTM5µL，上下游引物（10µmol•L-1）各0.2µL，用RNase-freeH2O補足至10µL。95℃預(yù)變性30s，95℃變性5s，60℃復(fù)性34s，共40個循環(huán)。每份樣品設(shè)3次重復(fù)。試驗數(shù)據(jù)應(yīng)用MicrosoftExcel2007軟件，采用2-ΔΔCt法計算其相對表達量[8]；應(yīng)用SPSS軟件對結(jié)果進行差異顯著性分析。應(yīng)用MicrosoftExcel2007軟件作柱狀圖。

1.2.5生物信息學(xué)分析CsANS序列通過在線NCBI的Blast功能進行氨基酸序列同源性比較；通過Protparam軟件對基因的分子量、等電點進行預(yù)測，初步分析目的基因的功能；通過TMHMM和TMPred軟件進行蛋白質(zhì)跨膜結(jié)構(gòu)的預(yù)測；SignalP4.1進行信號肽預(yù)測；在線SOPMA預(yù)測蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)。ProtCompVersion9.0進行亞細胞定位預(yù)測。啟動子序列通過在線PlantCAR[9]及Place軟件[10]預(yù)測其順式作用元件的種類、分布情況和生物學(xué)功能[11]。通過在線軟件BDGP[12]預(yù)測轉(zhuǎn)錄起始位點及可能的核心啟動子區(qū)域。

2結(jié)果與分析

2.1茶樹CsANS基因cDNA全長克隆

2.1.1茶樹CsANS基因PCR結(jié)果分析經(jīng)PCR擴增回收測序及使用DNAman軟件拼接獲得CsANS基因全長序列1000bp（GenBank收錄號為KT215319）。（圖1）該序列包含1個完整的閱讀框（15~977bp），編碼320個氨基酸，該基因含有起始密碼子ATG、終止密碼子TAA，并含有保守功能結(jié)構(gòu)域DIOX-N、20G-Fell-Oxy，屬于DIOX-N和20G-Fell-Oxy超級家族。

2.1.2茶樹CsANS基因的進化分析將武夷奇種C18茶樹ANS基因的氨基酸序列與已知的茶樹、高叢越橘（Vacciniumcorymbosum）、和甘薯（Ipomoeabatatas）等11種植物ANS基因的氨基酸序列進行同源進化樹分析（圖3）。發(fā)現(xiàn)所克隆的ANS蛋白與同屬茶樹ANS蛋白（登錄號：AY830416.1）的一致性高達100%。與其他物種比較，發(fā)現(xiàn)茶樹ANS蛋白在親緣關(guān)系上與高叢越橘最近，同源性為78%。

2.1.3CsANS基因氨基酸生物信息學(xué)分析通過ProtParam軟件對CsANS氨基酸進行基本信息分析可知，CsANS基因編碼320個氨基酸；相對分子量36113.6kD；理論等電點pI為6.23；負電荷殘基（Asp+Glu）為46個，正電荷殘基（Arg+Lys）為43個；不穩(wěn)定指數(shù)為41.05，屬于不穩(wěn)定蛋白；脂溶系數(shù)為：88.97，平均疏水性（GRAVY）為－0.397；分子式：C1626H2576N432O472S12，總原子數(shù)為5118，氨基酸組成中谷氨酸含量最高，占總氨基酸的10.3%；其次為甘氨酸，占6.9%，其他氨基酸占82.8%。利用在線軟件TMHMMServerv.2.0工具預(yù)測CsANS蛋白的跨膜螺旋區(qū)，如圖4顯示，該蛋白不是膜蛋白，無跨膜螺旋區(qū)。使用TMpred預(yù)測也顯示蛋白都分布在膜外，無跨膜蛋白。通過在線軟件COILS對CsANS氨基酸預(yù)測，在CsANS蛋白的25個氨基酸左右預(yù)測到強超螺旋信號。經(jīng)過SignalP-4.1預(yù)測信號肽顯示，CsANS編碼的氨基酸不含信號肽，不是分泌蛋白。對氨基酸的二級結(jié)構(gòu)預(yù)測顯示CsANS編碼的氨基酸中α螺旋結(jié)構(gòu)較多，有125個占所有氨基酸的39.06%，其次為無規(guī)則卷曲占31.87%，延伸鏈占17.81%，β折疊所占比例最低為11.25%。通過ProtCompVersion9.0軟件進行亞細胞定位預(yù)測，其亞細胞定位在細胞質(zhì)。

2.2CsANS基因啟動子克隆

2.2.1CsANS基因啟動子擴增結(jié)果以武夷奇種C18的DNA為模板，經(jīng)3輪巢式PCR反應(yīng)后，擴增到1條大于1000bp的目的片段（圖5）。將該片段進行克隆、測序，結(jié)果顯示，獲得的片段實際長度為1236bp。序列經(jīng)過分析整理后，以ATG為起始位點，得到茶樹CsANS上游長度為1010bp的DNA序列。

2.2.2茶樹CsANS啟動子轉(zhuǎn)錄起始位點的預(yù)測經(jīng)過啟動子轉(zhuǎn)錄起始位點在線預(yù)測，茶樹CsANS基因1010bp的5′端調(diào)控序列可能存在3處核心啟動子區(qū)域，位于35~85、316~366、480~530bp，分值分別為0.96、1和0.88，可能的轉(zhuǎn)錄起始位點分別為G、C和T。此結(jié)果可推測位于316~366bp的序列很可能就是該基因真正的核心啟動子區(qū)域，轉(zhuǎn)錄起始位點為位于第357bp的C（圖6）。

2.2.3茶樹CsANS基因啟動子順式元件分析啟動子生物學(xué)功能的在線預(yù)測結(jié)果表明，CsANS基因啟動子區(qū)域中，除了含有大量的核心啟動子元件如CAAT-box和TATA-box之外，還存在多種順式元件，如脫落酸相關(guān)元件ABRE，厭氧誘導(dǎo)相關(guān)的元件ARE，熱應(yīng)激反應(yīng)相關(guān)元件HSE，晝夜控制調(diào)節(jié)元件circadian，低溫應(yīng)答元件LTR，光響應(yīng)相關(guān)元件Sp1、ACE、I-box及MYB結(jié)合位點等（表2）。

2.3相對熒光定量PCR表達分析以18S-rRNA為內(nèi)參，采用實時熒光定量PCR對不同遮光處理及未處理的武夷奇種C18葉片CsANS基因表達進行了分析，結(jié)果（圖7）表明，其表達量在全光照處理（CK）時較高，75%遮光時較低。隨著遮光度增加，呈現(xiàn)下調(diào)趨勢。說明茶樹葉片在光照強時花青素合成酶（ANS）表達量高，光照弱時表達量低。

3討論

CsANS是紫葉茶樹花青素合成的最后一個酶，也是將無色花青素經(jīng)氧化脫水形成紅紫色花青素的最關(guān)鍵酶，此中間產(chǎn)物進一步與3-O-葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶（3GT）偶聯(lián)并且被傳送到液泡中，形成顯色的3-O-糖苷化花青苷[13]，在植物色澤形成中具有重要作用[14]。ANS基因最初是利用轉(zhuǎn)座子標(biāo)簽技術(shù)從玉米的A2突變體中鑒定和克隆得到[15]，近年來在茶樹（AY830416.1）、擬南芥（AT4G2288）、小麥（T.aestivum，AB247921）[16-17]等多種植物中也已經(jīng)得到其克隆。本研究從武夷奇種C18中克隆得到了CsANS的cDNA全長序列，該基因編碼的蛋白具有典型ANS蛋白的保守結(jié)構(gòu)域：DIOX-N、20G-Fell-Oxy。DIOX-N（嗎啡合成非血紅素加氧酶的N-末端）是蛋白質(zhì)與2-酮戊二酸/鐵（Ⅱ）依賴性雙加氧酶活性的高度保守的N-末端區(qū)域。2OG-FeⅡ_Oxy氧化酶結(jié)構(gòu)域由2-酮戊二酸和Fe(Ⅱ)-依賴的氧化酶超家族組成，該家族包括脯氨酰4-羥化酶α亞基的C末端。全酶由一個α2β2復(fù)合物組成，α亞基是其主要的活性位點。能夠催化反應(yīng)：前膠原L-脯氨酸+2-酮戊二酸+O2=前膠原反式-4-羥基-L-脯氨酸+琥珀酸+CO2[14]。與其他已知的ANS蛋白相比，CsANS編碼的氨基酸具有較高的同源性，它與高叢越橘（JN654701.1）的同源性較高，一致性為78%。所以推斷CsANS與高叢越橘中典型的花青苷元合成酶基因的生物學(xué)功能類似。環(huán)境信號激活花青素苷合成途徑，并促使茶樹葉片開始積累花青素[18-20]。

不同的外界環(huán)境因子下，葉色會隨之改變。光照是影響花青素苷合成最重要的環(huán)境因子之一。Hong等[21]對茶樹進行暗光處理后發(fā)現(xiàn)ANS基因表達水平下降。Rosati等[17]從連翹中克隆得到ANS基因，并證明在Forsythin的花瓣中由于缺少ANS基因，所以形成無花色素苷。結(jié)合實時熒光定量PCR數(shù)據(jù)可以看出：不同遮光處理及全光照處理的武夷奇種C18葉片中CsANS基因均有表達；全光照處理下，ANS基因表達量較高，75%遮光時較低，且遮光度增加，ANS基因表達量減少。這表明光照強時ANS基因表達量較高，光照弱時ANS基因表達量較低；CsANS基因?qū)τ谖湟钠娣NC18葉片色澤形成過程可能起主要作用，推斷與其基因的催化功能吻合。近年來ANS啟動子在洋蔥（AlliumcepaL.）、三色堇（Viola×wittrockianaGams.）、紫心甘薯[Ipomoeabatatas(L.)Lam.]中已經(jīng)得到克隆[22-24]。洋蔥、紫心甘薯和三色堇的ANS啟動子除含有多個CAAT-box、TATA-box等基本啟動子元件外，還含有與MYB轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合的元件，以及參與光響應(yīng)、逆境、激素應(yīng)答的順式作用元件。這與本研究中武夷奇種C18的ANS啟動子發(fā)現(xiàn)的順式作用元件相符，說明不同植物間ANS基因功能類似。武夷奇種C18的ANS啟動子中發(fā)現(xiàn)了6種與光反應(yīng)調(diào)控有關(guān)的順式作用元件，結(jié)合CsANS基因在不同光強下表達量的變化，可以推測ANS是個受光照調(diào)控的基因。ANS基因在其他物種中參與光反應(yīng)的研究已有報道[25-26]，而從啟動子角度來研究這類基因功能還鮮有報道，本實驗下一步可以構(gòu)建ANS基因的啟動子缺失載體，轉(zhuǎn)化到植株中，通過光照處理研究該啟動子是否為光誘導(dǎo)型啟動子，確定啟動子核心啟動區(qū)，對光照調(diào)控ANS基因的原理加以闡釋。

作者：金琦芳 陳志丹 孫威江 林馥茗 薛志慧 黃艷 唐秀華 單位：福建農(nóng)林大學(xué)園藝學(xué)院 福建農(nóng)林大學(xué)安溪茶學(xué)院 閩臺特色作物病蟲害生態(tài)防控協(xié)同創(chuàng)新中心