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《生物工程學報雜志》2014年第六期

1發酵抑制物解除策

抑制物解除的基本策略按照處理對象的不同，可以分為3種：木質纖維素物料脫毒、抑制物耐受菌篩選和過程控制優化。

1.1木質纖維素物料脫毒木質纖維素物料脫毒是指針對酸解、堿解、汽爆等預處理后的物料，通過一定手段，去除抑制物的過程。目前木質纖維素物料脫毒策略大體上可以分為物理法、化學法和生物法預處理3大類。物理法是直接去除水解液中的有毒物質，而化學法和生物法在于將有毒物質轉化為無毒物質。目前，文獻已報道的物理法包括水洗法、蒸發法、吸附法、萃取法、離子交換法、電滲析法等。水洗法常用于去除汽爆預處理產生的可溶性發酵抑制物[9]。蒸發法是一種簡單地去除預處理水解液中乙酸和糠醛等揮發性抑制物的方法[10]。萃取法則是利用糖類與抑制物在萃取劑中溶解性的不同，用溶劑將抑制物從發酵溶液中分離出來，如采用乙酸乙酯萃取可以去除木質纖維素水解液中56%的乙酸和所有的糠醛、香草醛和4-羥苯甲酸[11]。吸附法主要利用樹脂和活性炭具有的較強的吸附能力，去除水解液中的抑制物。一般地，脫毒的效果依次為陰離子交換樹脂>中性樹脂>陽離子交換樹脂[12]。在堿性條件下，陰離子交換樹脂能有效地去除陰離子和中性抑制物。活性炭對抑制物的去除效果受抑制物性質、水解液pH、處理溫度和時間以及活性炭濃度的影響[13]。電滲析是將陰陽離子交換膜交替排列于正負電極之間，用特質的隔板將其隔開，組成淡化和濃縮兩個系統，在直流電源的作用下，以電位差為推動力，利用膜材料的選擇透過性，把電解質從溶液中分離出來，從而實現溶質的分離、濃縮、精制和提純。雙極性膜是一種新型的離子交換復合膜。它由陽離子交換層(N型膜)和陰離子交換層(P型膜)復合而成，在直流電場的作用下將水離解，在膜兩層分別得到氫離子和氫氧根離子。雙極性膜電滲技術目前已經應用于酸的生產和回收工藝[14-15]。化學法主要是通過加入化學試劑使水解液中的抑制物形成沉淀或者通過調節pH使抑制物解離以去除毒性化合物的方法。目前應用最廣泛的是1945年Leonard和Hajny[16]報道的過量堿法(Overliming)，即先向預水解液中加入Ca(OH)2，調節pH到9−12，使抑制物沉淀，經過離心后再向得到的上清水解液中加入稀硫酸，調節pH到5.5。生物法是指利用酶或者微生物的降解作用以達到改變抑制物結構、降低毒性的方法[17]。生物法可分為酶處理和微生物處理。由于酶具有專一性，所以酶處理只能去除特定的抑制物。漆酶對酚類化合物的去除作用是明顯的，但對于乙酸、糠醛和羥甲基糠醛無去除作用[18]。灰蓋鬼傘擔子菌CoprinuscinereusIFO8371生產的過氧化物酶在H2O2存在的情況下，可以將香豆酸、阿魏酸、4-羥基苯甲酸、香草醛、紫丁香醛、香草酸6種化合物轉化成高分子量化合物，從而提高拜氏梭菌Clostridiumbeijerinckii利用木質纖維素水解液發酵丁醇的性能[19]。微生物脫毒指的是利用絲狀軟腐菌Trichodermareesei等微生物，去除水解液中乙酸、糠醛和安息香酸衍生物等的方法。例如，利用絲狀軟腐菌處理蒸汽爆破預處理過的柳樹半纖維素水解液，乙醇的產率可以提升3−4倍[20]。不同抑制物去除方法的優缺點對比見表1。

1.2抑制物耐受菌選育物理、化學或生物等脫毒方法只能部分去除纖維素水解液中的抑制物，無法完全克服抑制物對宿主細胞的毒害作用，并且生物脫毒的費用一般占到總投入的30%−40%，幾乎是木質纖維素生物轉化過程中投入最大的一項工序，使得諸如丁醇等發酵產物進一步降低了自己在同類產品中的競爭力[21]。因此，從發酵微生物本身出發選育高耐受的菌株，則成為解決底物抑制物問題的另一種有效方法。根據育種方式的不同，可以分為傳統誘變、代謝工程和合成生物學。傳統誘變是指通過一些強烈的化學誘變因子，如甲基磺酸乙酯(EMS)、亞硝基胍(NTC)、丙烯醇等，以及紫外線等物理誘變條件對出發菌進行誘變以獲取抑制物耐受菌株的方法。由于單一的誘變方法具有菌種性狀不穩定、突變方向隨機等缺點，最近幾年的研究多集中于復合誘變和菌種馴化。復合誘變是指利用多種誘變劑同時或者依次對出發菌進行處理。誘變劑的復合處理有一定的協同誘變效應，能增強誘變效果，并能將多種優良性狀集中于同一菌株[22]。馴化是指讓細胞長期在某一環境下生長，使其能夠適應并具有良好性狀的進化過程。馴化是在對機理知識理解不足的情況下獲得具有目標特性菌株的有效方法。丁明珠等以釀酒酵母為出發菌種，通過紫外誘變結合馴化的方法篩選出1株對于糠醛、苯酚和乙酸都有很強耐受能力的菌株[23]。Keating等[24]利用糠醛、5-羥甲基糠醛和乙酸溶液對釀酒酵母進行馴化，得到了一株在纖維素水解液中具有良好發酵效果的酵母菌株。Liu等[25]也利用馴化的方法得到了能耐受糠醛的酵母菌株，從而實現了對纖維素水解液中糠醛抑制物的原位脫毒。分子生物學技術的發展，使得產溶劑梭菌代謝工程改造成為了可能，外源基因和調控因子的引入，使代謝工程有別與傳統意義上的菌種改造。利用重組技術調控細胞中酶反應、優化代謝物的轉化與轉運，可以有效增強宿主細胞對于抑制物的耐受能力。楊雪雪[26]對釀酒酵母同源二倍體單基因缺失株文庫進行篩選，經過初篩、復篩、驗證等步驟，得到了163個糠醛抗性相關基因，并成功構造出雙倍體單基因缺失株siz1/siz1，dep1/dep1，sap30/sap30和單倍體單基因缺失株siz1，dep1，sap30菌株，其對10mmol/L糠醛的抗性比各自相應的野生型菌株要高出100倍。Li等[27]利用酵母全基因組表達譜芯片，研究了釀酒酵母在轉錄組水平上對糠醛和醋酸的代謝響應，發現增強HMG1基因可以提高胞內糠醛的轉化效率，從而增強菌體的耐受能力。Gorsich等[28]通過對釀酒酵母單基因突變體庫的篩選找到62種與糠醛耐受性相關的基因。過表達其中的葡萄糖-6-磷酸脫氫酶基因ZWF1后，釀酒酵母可以在高濃度的糠醛下生長，這可能是因為過表達ZWF1使得葡萄糖-6-磷酸脫氫酶的活性增加，為糠醛還原酶或依賴NADPH的脅迫應激酶類提供了更多的還原動力(NADPH)，進而提高了菌體耐受性。目前為止，所得到的各種抑制物耐受菌大多是通過馴化或者傳統誘變篩選得到的。由于抑制物對于宿主細胞的抑制機理還不明確，很難通過定向設計獲得具有高耐受性的菌種。因此，深入了解水解液中抑制物與細胞的相互作用關系，揭示細胞的脫毒機制，進而定向改造菌株，是當前代謝工程亟待解決的問題。

2新型抑制物解除工藝傳統預處理方法

[29-31]、菌種改造[24]等方法，對于突破木質纖維素抑制物瓶頸、實現木質素產業化生產是必不可少的[32]。但它們只專注于單一的技術突破，忽略了木質纖維素本身所具有的結構特點[33]。實際上，木質纖維素獨特的組成特點，可以為我們提供新的研究思路[34]；基于此，陳洪章課題組提出了“源頭降低抑制物——纖維素木質素分級轉化”煉制模式，為木質纖維素的開發和利用，探索出了一條全新的工藝路線；并在此基礎上，進一步提出了“原位脫毒——發酵促進劑設計技術”，它們共同組成了當前最新型的抑制物解除工藝。

2.1源頭降低木質纖維素抑制物的分級轉化煉制工藝木質纖維素原料具有結構復雜、不均一的多級結構。從細胞組成上，可以分為纖維狀的纖維細胞和雜細胞(包括導管、薄壁細胞、表皮細胞等)。纖維細胞木質素含量較高，具有較發達的次生壁，因此厚度較大。薄壁細胞腔大、壁薄、長度短，其成分主要為纖維素[35]。由于結構和形態上的差異，這兩類細胞所要求的預處理條件也是不同的[21]。纖維細胞，細胞壁木質化程度高，結構致密，受熱過程中傳質熱阻力大，且不易被撕裂；薄壁細胞，壁薄而腔大，即有利于傳質傳熱，有利于水蒸氣閃蒸對其物理撕裂。因此，針對不同組織細胞分別優化處理條件，開發出了二段汽爆分梳技術。其具體的工藝過程如下：1)將汽爆壓力控制在0.5−1.0MPa、維壓1−10min，對秸稈原料進行第一段蒸汽爆破處理。2)通過氣流分級裝置，將第一段汽爆物料進行分級，得到薄壁組織和纖維組織。薄壁組織可以直接用于纖維素發酵。3)將分梳得到的纖維組織在壓力為1−1.5MPa、維壓時間為1−10min條件下進行二段蒸汽爆破處理。二段汽爆分梳工藝，不同于傳統所指的二段汽爆工藝，前者采用較溫和的汽爆條件進行第一段汽爆，通過氣流分梳裝置將第一段物料(薄壁細胞)分級，得到薄壁組織和纖維組織，再將纖維組織在適當的條件下進行第二段汽爆。該工藝可以實現纖維素組分的有效分離，即能保證纖維組織達到較好的預處理效果，提高纖維原料的酶解效果，又能避免薄壁細胞的過度降解，從源頭控制了抑制物的產生，減少了脫毒單元操作的引入，簡化了工藝。在二段汽爆以后，將汽爆后的秸稈渣送入1.2m3酸水解罐中，同時加入0.3%−0.5%的稀硫酸，物料和稀硫酸的體積比控制在1∶5−1∶7，在110−120℃的溫度下水解0.5−1.0h，然后利用螺旋擠壓機將水解液中的液體和固體分開，分別得到水解液和水解渣。水解液主要成分為非半纖維素，水解渣中主要為木質素和纖維素。繼而采用2%的堿液提取殘渣中的木質素，提取率可達96%，隨后利用逐級酸性沉淀(pH5−2)分級木質素的方法，可以制得小于6kDa，6−10kDa，10−20kDa和大于20kDa等不同分子量范圍的木質素，用于不同功能原料的開發。本課題組的研究發現，汽爆秸稈酶解液中并不存在糠醛、5-羥甲基糠醛與乙酸的抑制問題，而汽爆秸稈木質素降解物才是抑制丁醇發酵的主要原因[36]。由于從源頭去除了木質素對于半纖維素和纖維素發酵的干擾，發酵液中的抑制物種類較少，濃度較低，經過簡單脫毒(5%−10%的活性炭吸附室溫下處理8−12h)，即可用于正常的丁醇發酵。基于以上重大技術突破，組建出與其技術相配套的自主加工的工業化裝置系統，完成了年產600t秸稈丁醇中試實驗。所建立的技術工藝在中國吉林省松原市成功用于“30萬t/年秸稈煉制”產業化生產。該生產線將為秸稈作為工業原料生產能源、材料和化學品提供新的思路和產業化示范。該工藝有以下幾個特點：1)可以從源頭降低抑制物的產生，簡化了操作工序，降低了預處理的成本。2)通過組分分離，保證了發酵底物的純度，提高了溶質的傳質速率和酶的接觸面積，提高了發酵效率。3)實現了秸稈全組分高價化經濟全利用，通過經濟分攤，增加了木質纖維素的經濟競爭力。本實驗室所提出的“源頭降低抑制物——纖維素木質素分級轉化”煉制模式，為木質纖維素發酵抑制物的解除及木質纖維素開發利用提供了全新的技術路線。

2.2基于木質纖維素發酵特點的過程強化工藝從發酵微生物本身出發，通過增加發酵液中特殊的物質，來提高微生物細胞對抑制物的耐受能力；或者選育出能夠耐受木質纖維素水解液中各種抑制物，并具有較高發酵性能的微生物，以達到脫毒的目的，這種方法通常被稱為抑制物的原位脫毒。在木質纖維素發酵過程中，往往微量級別(mg/L)的“特殊物質”，就可以實現目標產物發酵效率的成倍增長，具有巨大的開發價值。這些“特殊物質”稱為發酵促進劑，大多數屬于電子穿梭化合物，即具有多種氧化態和還原態的物質。它們在細菌代謝過程中扮演著重要的角色。外源添加這種電子穿梭化合物，可以改變胞內的電子流向，提高電子傳遞速率，進而理性調控生物胞內的能量狀態和生理狀態，提高菌體的耐受性和目標產物的合成能力。常見的電子穿梭化合物，包括中性紅、亞甲基藍、聯芐吡啶、二磺酸蒽醌、Fe(OH)3和甲基紫精等。二磺酸蒽醌常用作腐殖酸的類似物，用于研究醌類物質在電子傳遞中的作用。外源添加還原性的二黃酸蒽醌可以改變Clostridiumbeijerinckii的代謝模式，提高H2的產量。Fe(OH)3是最常用的氫氧化物，在厭氧發酵中是良好的電子載體；甲基紫精同鐵氧化還原蛋白的電勢相似，可以參與一系列生化反應過程中的電子傳遞過程，通過鐵氧化還原蛋白-NAD還原酶增強NAD(P)+的電子流。1979年，Hongo等[37]首次提出了“電子能方法”(Electroenergizing)的概念，他們向黃色短桿菌Brevibacteriumflavum菌發酵液中添加中性紅(電子載體)，發現谷氨酸的產量明顯提高，而且從陰極傳遞的電子幾乎全部被宿主細胞吸收。遺憾的是，他們并沒有深入研究這些電子如何進入生化代謝途徑。Yarlagadda等[38]通過外源添加甲基紫精，使得Clostridiumsp.BC1的乙醇和丁醇產量分別提高了28倍和12倍，同時菌體對于丁醇等物質的耐受性明顯提升。Liu等[39]認為這些物質與胞內的NADPH/NADP+和NADH/NAD+總比例有著直接的聯系，NADPH/NADP+和NADH/NAD+總比例是主導胞內代謝狀態的最主要因素。生物信息數據庫KEGG中包括855和1064個氧化還原反應，分別有106和88種以NAD+和NADP+為輔因子的酶催化反應(到2012年10月為止)，幾乎涉及所有細胞骨架類化合物的構建(如氨基酸、脂類和核酸)。通過改變胞內NADH的水平可以實現胞內代謝流的調控，提高目標產物的產量，增強菌體的抑制物耐受性。遺憾的是，目前對于發酵促進劑的研究，主要集中于抑制物耐受機理的闡明，實驗過程中多采用合成培養基，而實際生產方面的應用幾乎沒有開展。基于此，我們率先開展了電子載體物質、氧化還原物質與木質纖維素抑制物原位脫毒關聯性的研究，利用秸稈水解液進行了實驗驗證，取得了良好的發酵結果；首次提出了“發酵促進劑設計技術”理念，綜合運用前體工程、理論化學、計算化學和計算機輔助模擬等手段，構建出促進劑開發平臺技術，為傳統的發酵工藝提出了新的研究思路。其主要內容為：首先，運用組合化學手段，對已有的發酵促進劑進行歸類分析，獲取其決定作用的“母核”，然后運用虛擬組合庫進行大通量篩選。虛擬組合庫主要出自3個來源：一種是基于分子片段的直接枚舉而產生的新的分子庫；一種是基于反合成分析原理的片段化及重組而產生的新分子庫；另一種是基于分子構象疊合和遺傳算法中的雜交原理的分子重組而產生的新的分子。目前，已經成功完成了系列產品的研發，即將進行實際發酵的生產驗證。

3展望

發酵抑制物制約著木質纖維素的發酵效率，是木質纖維素生物煉制的主要瓶頸。現有的物理法、化學法、生物法等方法，只適用于特定抑制物的去除，而且投入成本較高，難以實現木質纖維素的大規模發酵。隨著抑制物耐受機理研究的日益深入和以合成生物學為代表的菌種改造技術的成熟，抑制物耐受菌株的理性構建將成為可能，同時發展“高效、清潔、低成本”的抑制物解除工藝，必將助力于木質纖維素的大規模生產。筆者認為，充分結合原料的結構特點，發展“分級轉化”煉制模式，從源頭降低抑制物的產生，將是今后木質纖維原料預處理的發展趨勢。“分級轉化”煉制模式為木質纖維素的產業化提供了全新的思路和工藝“范本”，將對生物質煉制產業的發展起到推動作用。

作者：王嵐夏夢雷陳洪章單位：中國科學院過程工程研究所生物質煉制工程北京市重點實驗室