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《中南民族大學(xué)學(xué)報(bào)》2015年第五期

小球藻(Chlorella)是一類普生性單細(xì)胞綠藻，其培養(yǎng)過(guò)程簡(jiǎn)單、生長(zhǎng)繁殖速度快、生態(tài)分布廣，可利用光能進(jìn)行自養(yǎng)生長(zhǎng)，還可在異養(yǎng)條件下生長(zhǎng);小球藻含有多糖和糖蛋白，具有抗腫瘤、抗病源菌、抗病毒感染和增強(qiáng)免疫力等活性［1，2］，在逆境環(huán)境條件下(如氮短缺)，小球藻細(xì)胞會(huì)大量積累油脂［3］;藻細(xì)胞還能有效地固定空氣、工業(yè)廢氣和可溶性碳酸鹽中的CO2［4］，因此小球藻的應(yīng)用價(jià)值很高．為篩選活力強(qiáng)、生長(zhǎng)快、活性代謝產(chǎn)物產(chǎn)量高的小球藻，方便、快捷、準(zhǔn)確地檢測(cè)在特定環(huán)境下生長(zhǎng)的藻細(xì)胞活性的方法顯得尤為重要．一般通過(guò)分析光合速率和熒光釋放量來(lái)測(cè)定藻類光合生物細(xì)胞活性，但通常需要昂貴的設(shè)備儀器，技術(shù)操作要求高［5］．動(dòng)物細(xì)胞的活性檢測(cè)主要通過(guò)間接觀察DNA的合成含量和直接檢測(cè)細(xì)胞代謝活性，前者常用同位素3H-TdR摻入法，設(shè)備昂貴且操作復(fù)雜，存在放射性污染［6］;而后者常用四甲基偶氮唑鹽(MTT)比色法，在測(cè)定時(shí)產(chǎn)生不溶于水的結(jié)晶物，需要加有機(jī)溶劑溶解后方能比色，若溶解不全則會(huì)影響測(cè)定結(jié)果［7］，為解決這一問(wèn)題，Buttke等設(shè)計(jì)了一種新型的MTT類似物MTS，它能被活細(xì)胞線粒體的琥珀酸脫氫酶降解而產(chǎn)生棕黃色水溶性甲臢，這種帶顏色的物質(zhì)通過(guò)酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀在492nm處捕捉到其光譜吸收，通過(guò)吸光度反映活細(xì)胞數(shù)量和狀態(tài)［8］，MTS法快速準(zhǔn)確，已被廣泛應(yīng)用于動(dòng)物細(xì)胞活性的測(cè)定．相比動(dòng)物細(xì)胞，小球藻細(xì)胞具有細(xì)胞壁和葉綠體，用MTS比色法測(cè)定小球藻細(xì)胞活性時(shí)，細(xì)胞壁是否會(huì)阻礙MTS進(jìn)入藻細(xì)胞，葉綠體內(nèi)相關(guān)酶和光合作用是否干擾MTS反應(yīng)等，本文針對(duì)這些問(wèn)題，對(duì)MTS法測(cè)定小球藻細(xì)胞活性的可行性進(jìn)行了系統(tǒng)研究．

1材料與方法

1．1材料和儀器實(shí)驗(yàn)藻種蛋白核小球藻(Chlorellapyrenoidosa)來(lái)自中南民族大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院發(fā)酵工程實(shí)驗(yàn)室，經(jīng)抗生素法制備無(wú)菌藻株．MTS(PromegaCorporation，WI，USA)，3-(3，4-二氯苯基)-1，1-二甲基脲(DCMU，SigmaChemicalCo)，酶標(biāo)儀(MultiskanAscent，ThermoElectroncorporation，Shanghai，China)，脈沖調(diào)制熒光儀(WATER-PAM，WALZGermany)．

1．2小球藻的培養(yǎng)用Bristol培養(yǎng)基進(jìn)行藻的培養(yǎng)，主要成分為:0．25g/LNaNO3，0．075g/LK2HPO4•3H2O，0．075g/LMgSO4，0．025g/LCaCl2•2H2O，0．175g/LKH2PO4，0．025g/LNaCl，0．005g/LFeCl3•6H2O，1mLFe-EDTA溶液，40mL土壤提取液和1mL/LA5微量元素，A5中包含有以下成分:0．22g/LZnSO4•7H2O，2．86g/LH3BO3，1．81g/LMnCl2•4H2O，0．079g/LCuSO4•5H2O，0．039g/L(NH4)6Mo7O24•4H2O．取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)的小球藻以無(wú)菌方式接種到新鮮滅菌的Bristol培養(yǎng)基中，用漁用泵通氣，空氣過(guò)濾器過(guò)濾空氣，熒光燈提供照明，光照強(qiáng)度為4klx，溫度為25～27℃，連續(xù)照明培養(yǎng)．

1．3銅離子處理藻生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期后進(jìn)行銅離子脅迫，濃度梯度分別為5，15，25，30，35μmol/L，設(shè)置對(duì)照組，置于搖床中光照強(qiáng)度為4klx，溫度為25～27℃，連續(xù)照明培養(yǎng)40h．

1．4細(xì)胞密度和細(xì)胞活性的測(cè)定用血球計(jì)數(shù)板法計(jì)量細(xì)胞密度;細(xì)胞活性的測(cè)定方法為:取400μL藻液加上80μLMTS溶液于1．5mL的EP小管中．另以400μL的培養(yǎng)基加上80μLMTS溶液在相同的條件下作為對(duì)照．充分混合后在一定溫度下保溫．以15000r/min離心1min，取其上清于96孔板中．置于酶標(biāo)儀中，在492nm處測(cè)定吸光值．

1．5葉綠體光合作用抑制以3-(3，4-二氯苯基)-1，1-二甲基脲作為葉綠體光合作用抑制劑，MTS測(cè)定活性前在藻細(xì)胞中加入3μM的DCMU保溫5min，抑制葉綠體光合作用，另外以不加DCMU的作為對(duì)照組．

1．6葉綠素?zé)晒獾臏y(cè)定參考文獻(xiàn)［9］，采用脈沖調(diào)制熒光儀測(cè)定不同濃度銅離子脅迫下的藻細(xì)胞的葉綠素?zé)晒猓疁y(cè)定前吸取2mL藻液放入反應(yīng)小室中，暗適應(yīng)10min后測(cè)定．光化光為100μmol•m－2•s－1，閃光時(shí)間為1s，測(cè)得藻細(xì)胞的最大光化學(xué)量子產(chǎn)量(Fv/Fm)．

2結(jié)果與分析

2．1葉綠體對(duì)MTS測(cè)定細(xì)胞活性的影響圖1為加有葉綠體電子傳遞鏈抑制劑DCMU與對(duì)照組藻細(xì)胞活性的比較．DCMU是一種葉綠體電子傳遞鏈抑制劑，它抑制了從PSII上的Q向PQ的電子傳遞，進(jìn)而抑制葉綠體光合作用．結(jié)果顯示，經(jīng)DCMU預(yù)處理的藻細(xì)胞活性與未經(jīng)DCMU預(yù)處理的對(duì)照組細(xì)胞無(wú)顯著性差異(p＞0．05)，可見葉綠體光合作用的電子傳遞及其酶系對(duì)用MTS測(cè)定細(xì)胞活性值不構(gòu)成影響，即在有光和無(wú)光條件下MTS比色法測(cè)定細(xì)胞活性可用于有光合作用的藻細(xì)胞．

2．2細(xì)胞密度對(duì)MTS測(cè)定細(xì)胞活性的影響活性細(xì)胞產(chǎn)生的NADH和NADPH參與MTS的顏色反應(yīng)，故492nm處的也吸光值依賴于細(xì)胞密度［5］．圖2為不同細(xì)胞密度的蛋白核小球藻在相同MTS體系下測(cè)定的藻細(xì)胞活性，經(jīng)MTS試劑與藻細(xì)胞保溫后，在492nm處測(cè)得的吸光值與藻細(xì)胞的密度成線性關(guān)系(R2=0．9975，n=7)．說(shuō)明用MTS測(cè)定藻細(xì)胞活性時(shí)，每個(gè)樣品需要通過(guò)稀釋或濃縮將藻細(xì)胞密度調(diào)整到相同或至少相近的值以確保MTS細(xì)胞活性值的可比性．

2．3溫度對(duì)MTS測(cè)定細(xì)胞活性的影響MTS還原反應(yīng)是一個(gè)酶介導(dǎo)的反應(yīng)［5］，顏色反應(yīng)與保溫溫度密切相關(guān)．圖3為反應(yīng)的溫度對(duì)MTS測(cè)定細(xì)胞活性的影響．由圖3可見，37℃較27℃更有利于MTS反應(yīng)，顏色反應(yīng)速率明顯加快，為縮短測(cè)定時(shí)間，當(dāng)細(xì)胞密度較低時(shí)反應(yīng)溫度可選擇在約37℃，若細(xì)胞密度高時(shí)可適當(dāng)降低溫度測(cè)定細(xì)胞活性．保溫20min時(shí)顏色反應(yīng)值已能被酶聯(lián)儀所捕捉而顯示數(shù)據(jù)，說(shuō)明MTS能順利進(jìn)入有細(xì)胞壁的小球藻細(xì)胞參加反應(yīng)并能在一定的反應(yīng)時(shí)間后被檢測(cè)，細(xì)胞壁不是MTS反應(yīng)的屏障．

2．4藻細(xì)胞MTS活性與最大光化學(xué)量子產(chǎn)量的關(guān)系最大光化學(xué)量子產(chǎn)量(Fv/Fm)反映了PSII反應(yīng)中心光化反應(yīng)的最大潛在量子產(chǎn)率，多數(shù)光合生物在無(wú)脅迫的情況下為常數(shù)，但當(dāng)光合生物受到脅迫或傷害時(shí)會(huì)明顯下降，F(xiàn)v/Fm具有高靈敏度和特異性，常用于反映藻細(xì)胞代謝活性和光合作用效率的大小［9，10］．為了表征MTS法測(cè)定的細(xì)胞活性對(duì)小球藻的光合損傷狀態(tài)，本文利用脈沖調(diào)制熒光儀測(cè)定了不同濃度Cu2+脅迫下的藻細(xì)胞的最大光化學(xué)量子產(chǎn)量(Fv/Fm)，見圖4中Cu2+濃度為30μmol/L時(shí)藻細(xì)胞的492nm處的吸光值為0．07，F(xiàn)v/Fm的值降低至0．495，Cu2+濃度為35μmol/L時(shí)，MTS細(xì)胞活性值和Fv/Fm變化不大，且藻液發(fā)黃出現(xiàn)沉淀，出現(xiàn)藻細(xì)胞死亡的現(xiàn)象．電子探測(cè)顯微分析顯示，海洋藻類在0．05mg/LCu2+中暴露5d后，代謝作用受阻［11］．本文中高于30μmol/L的Cu2+濃度連續(xù)脅迫處理40h后，MTS法不能很好地表征藻細(xì)胞活性，可能由于蛋白核小球藻的代謝作用受阻，導(dǎo)致藻細(xì)胞的細(xì)胞膜的通透性發(fā)生變化，不能把MTS送至線粒體處發(fā)生反應(yīng)，或由于藻細(xì)胞線粒體中的琥珀酸脫氫酶在高濃度Cu2+作用下變性，不能把MTS降解成黃色水溶性甲臢，未能測(cè)定到MTS細(xì)胞活性．當(dāng)Cu2+≤30μmol/L時(shí)處理的藻細(xì)胞MTS活性值與最大光化學(xué)量子產(chǎn)量(Fv/Fm)呈良好線性關(guān)系(R2=0．9151，n=5)，說(shuō)明MTS細(xì)胞活性值在小球藻存活狀態(tài)下的測(cè)定值可很好地表征細(xì)胞的光合活性，作為損傷度不高的小球藻活性測(cè)定的替代方法．

3結(jié)語(yǔ)

小球藻細(xì)胞壁不會(huì)阻礙MTS進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)參與反應(yīng)，光合作用的電子傳遞及其酶系對(duì)MTS測(cè)定細(xì)胞活性值沒有影響;測(cè)定細(xì)胞活性時(shí)需要將藻細(xì)胞稀釋到相近的濃度，37℃的溫度有利于MTS的反應(yīng)速率加快，縮短測(cè)定時(shí)間;在藻細(xì)胞存活狀態(tài)下，藻細(xì)胞的MTS細(xì)胞活性值和脈沖調(diào)制熒光儀測(cè)定的藻細(xì)胞樣品的最大光化學(xué)量子產(chǎn)量的值間有較好的線性關(guān)系，可以很好地用來(lái)表征藻細(xì)胞的活性．

作者：王海英 許燕 王溢 甘科 單位：中南民族大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院