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《解剖學報》2016年第二期

［摘要］

目的比較移植性腫瘤動物模型與慢病毒介導的膠質瘤模型在教學中的應用效果。方法選取50名臨床8年制5年級學生，根據不同的實驗操作，將學生隨機分為移植性腫瘤動物模型組(n=25)以及慢病毒介導的膠質瘤模型組(n=25)。移植性腫瘤動物模型組以大鼠膠質瘤細胞系9L腦紋狀體注射Wistar大鼠模型進行實驗操作;而慢病毒介導的膠質瘤模型組則以慢病毒載體介導Ras的表達以及Akt的激活，注射膠質纖維酸性蛋白(GFAP)-Cre基因小鼠進行實驗操作。教學結束后比較兩組的教學反饋和教學成果。結果與移植性腫瘤動物模型組相比，慢病毒介導的膠質瘤模型組成員對該模型的教學反饋評價更高，該模型的重復性更好，使學生對腫瘤分子水平的認識更深入，差異具有統計學意義(P＜0.05)。結論慢病毒介導的膠質瘤模型在教學中應用具有可行性，不僅提供了一個較新的模型，也使得學生能夠從分子水平認識腫瘤，對于腫瘤的理解更為深入。

［關鍵詞］

慢病毒介導的膠質瘤模型;轉基因型腦膠質瘤模型;移植腦膠質瘤模型;教學;學生

神經膠質瘤簡稱膠質瘤，是最常見的原發性中樞神經系統腫瘤，約占所有顱內原發腫瘤的一半。由于其臨床治療效果不佳，預后性差等因素的影響，神經膠質瘤成為中樞神經腦腫瘤中發病率最高的原發性腫瘤。根據世界衛生組織的分類系統，腦膠質瘤根據其惡性程度可分為4個等級。其中Ⅲ和Ⅳ級膠質瘤惡性程度很高，患者的平均存活時間僅為1年。因此，建立穩定、可靠、易重復的膠質瘤動物模型，通過模型研究膠質瘤的發病機制，找出合理的治療方案非常必要。目前，膠質瘤動物模型可分為誘發性腦膠質瘤模型、移植腦膠質瘤模型和轉基因型腦膠質瘤模型3種。其中轉基因型腦膠質瘤模型的建立是基于人們對癌基因激活以及抑癌基因失活等認識不斷加深，以及轉基因和基因剔除技術的發展，是3種方法中最新的一種。該方法相比于另兩種方法，具有多種優勢:建立的系統更加穩定;重復性好;分子機制清楚。我們通過比較慢病毒介導的轉基因型膠質瘤模型［1］以及目前應用最多的移植腦膠質瘤模型在教學中的反饋評價，分析慢病毒介導的轉基因型膠質瘤模型是否適合作為教學模型，以及它作為教學模型的意義。

一、對象和方法

隨機抽取臨床8年制5年級學生(n=50)作為實驗操作者，根據不同的操作，將學生分為實驗組和對照組。實驗組為慢病毒介導的轉基因型膠質瘤模型組，對照組為移植腦膠質瘤模型組，每組25人，兩組學生隨機分組，年齡、相關基礎知識以及智力水平相當。實驗動物由上海交通大學醫學院實驗動物科學部提供，動物合格證號:［2012］038。2．操作方法實驗操作前由教師講解實驗所需的材料以及實驗中的注意事項，著重向學生闡明選擇的模型的發展背景，使學生對實驗材料有所認識。實驗組學生使用慢病毒載體使Ras表達或Akt激活，由于它們的表達受到Cre重組酶的控制，因此通過將病毒注入膠質纖維酸性蛋白(glialfibrillaryacidicprotein，GFAP)-CreTp53+/－基因小鼠海馬區或腦室下區，可導致膠質瘤的發生。其中GFAP-CreTp53+/－小鼠由GFAP-Cre轉基因小鼠與Tp53+/－小鼠進行雜交產生腫瘤抑制子(tumorsuppressor，Tp53)，8～16周鼠齡時用于實驗。使用氯胺酮麻醉小鼠，將少量的病毒(0.8μl，1×108IU)立體定位注射入小鼠。TomoH-RasV12lentiviralvectors和TomoAKTlentiviralvectors以1∶1混合注射。在注射后觀察小鼠的生存狀態，行為狀態以及體重的變化。觀察瘤的大小以及成瘤情況，并且進行病理組織學檢查。對照組學生使用大鼠膠質瘤細胞系9L腦紋狀體注射Wistar大鼠［2］，之后采取與實驗組相似的方法觀察大鼠生存以及行為狀態，觀察成瘤情況以及病理組織學檢查等。完成所有實驗后所有學生各自撰寫實驗報告，報告內容除了包括實驗目的、操作步驟等，需要著重撰寫:(1)實驗中出現的困難;(2)實驗后對于膠質瘤發生的認識。3．評價方法3.1統計實驗結果中成瘤大小、成瘤率。3.2課堂觀察的方法:以學生上課時的關注情況，對于課堂問題的參與應答情況作為評價的因素。3.3課后撰寫實驗報告的結果作為評價的因素3.4問卷調查:實驗教學結束以后，通過教學效果問卷對兩組學生進行調查，調查內容包括對該模型的認識以及對膠質瘤的認識程度等。4．統計學方法采用t檢驗比較兩組之間的差異，P＜0.05為差異有顯著性。

二、結果

1．兩組模型成瘤情況比較兩組模型的成瘤率都是100%，說明建立這兩種模型都可以用來成瘤，但實驗組形成的腫瘤大小更均一，而對照組腫瘤出現了較大或較小的現象。2．兩組學生課堂參與情況的比較兩組學生的上課關注情況被總結于表1中，通過比較可以看出兩組學生上課都很認真，并且積極參與討論，與教師形成互動。3．實驗報告的撰寫結果從實驗報告的得分上看(表2)，實驗組學生的成績更高一些，主要原因是該組學生對于膠質瘤的認識更深入，對膠質瘤的了解從宏觀到微觀都較對照組清晰。有多位對照組的學生都提到這種移植的方法的遺傳背景不清楚，這使得學生不能很好地理解膠質瘤形成原因。而實驗組在授課時教師就可以很清晰的闡明腫瘤的發生是由于癌基因的激活或者抑癌基因的失活所致，實驗中設計的材料也涉及到癌癥中一些信號通路的激活等分子方面的知識，這些都使得學生能夠很好地理解實驗安排的原因，將理論與實踐相結合。更有一些同學在報告中指出，其他已知的一些重要的癌基因也可以通過慢病毒介導在細胞中表達等，做到了舉一反三，說明慢病毒介導的膠質瘤模型使用更為靈活。4．問卷調查結果與分析通過比較兩組學生的問卷，學生對實驗本身的感興趣程度基本相似，但實驗組學生對實驗設計的理解更為清楚，知道為什么會選擇相關基因的表達，為什么選擇GFAP-CreTp53+/－基因小鼠。對實驗的因果由來了解都較清楚。相反，對照組的學生由于該模型自身的局限性，不能清楚知道其遺傳背景，對膠質瘤的認識不夠深入全面。學生問卷調查表明:慢病毒介導的膠質瘤模型能更好地提高學生的學習興趣、自學能力、學習主動性和獨立性，加強學生對理論知識的理解，提高學生臨床技能、臨床思維能力和綜合能力。慢病毒介導的膠質瘤模型更為學生所接受和喜愛，慢病毒介導的膠質瘤模型在激發學生學習興趣，提高學生主動性，加深課堂知識理解和知識的長期記憶上效果尤著，兩組比較差異有統計學意義。

三、討論

通過上述兩組的比較，我們發現實驗組學生與對照組學生對實驗本身的接受情況是類似的，但實驗組學生通過該實驗課對膠質瘤的認識更為深入，從分子水平上解釋了腫瘤的發生，這也是轉基因膠質瘤模型優于移植型膠質瘤模型的地方。染色體畸變、堿基缺失或突變，或者腫瘤相關基因表觀修飾改變是腫瘤發生的主要原因［4］。許多膠質瘤患者的腫瘤組織中存在PTK/Ras/PI3K、p53和Rb等基因的突變，其中p53、pTen、EGFR、CDKN2A/2B和NF-1是突變頻率最高的基因。膠質瘤的形成是一個多因子、多種生物學行為的過程，包括某些通路異常激活、細胞周期被破壞等［5］。利用外源性方法模擬某種腫瘤形成過程就可以建立相應的動物模型［6］。實驗組選取的小鼠是GFAP-CreTp53+/－基因重組小鼠，腫瘤抑制因子Tp53的突變有利于腫瘤的發生［7］。通過轉導慢病毒促進Ras［8］以及Akt［9，10］的表達也進一步促進了腫瘤的發生。正是由于這些基因突變的發現，為建立轉基因膠質瘤動物模型提供了重要的基礎。同時慢病毒介導的膠質瘤動物模型，載體容易構建，表達系統穩定，免疫原性較小。最重要的是，在使用該方法時，可以根據實際情況調整相關基因，通過促進其他單一或多個癌基因的表達，檢測成瘤率，因而非常靈活也更加實用。本研究表明，慢病毒介導的膠質瘤動物模型分子機制更為明確，能夠更清楚地從分子水平解釋腫瘤發生的原因，使學生對于膠質瘤的發生有進一步的認識，因此適合作為教學模型推廣使用。

作者：宋大勇 李志強 權哲 趙軍 張寧 許大遠 單位：上海交通大學附屬第六人民醫院南院