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《南方醫科大學學報》2016年第二期

摘要：

目的在高倍鏡下觀察精子中段的形態，從而評估精子中心體功能，從而探討精子中段形態與中心體功能的關系以及中段形態不同的精子對胚胎發育的影響。方法針對57例在成都市錦江區婦幼保健院生殖醫學中心行ICS（I卵胞漿內單精子注射）技術治療的患者，將首先在低倍鏡（×200~×400）下挑選過的精子再次利用MSOME（精子細胞器官形態學檢查）系統，在6000倍放大鏡下對精子進行精子中心體形態分組（A組：1≤a/b≤1.2；B組：a/b≥1.5；C組：其他不規則形態），然后分別將這3組精子注射入卵后，分組進行胚胎培養，最終觀察每組胚胎發育和著床情況。結果A，B，C3組比較發現D3移植優胚率（79.7%vs55.6%vs33.3%）和胚胎著床率（43.2%vs11.1%vs0%）在3組之間均有顯著性差異（P<0.05）；而正常受精率（73.3%vs80.4%vs63.5%）、囊胚利用率（23.2%vs22.2%vs9.09%）、胚胎冷凍率（29.2%vs25.0%vs13.0%）、D3優胚率（35.3%vs37.8%vs18.8%）上均無顯著性差異（P>0.05）。結論中心體形態較好的精子注射入卵后，可獲得較高正常受精的胚胎，能顯著提高第3天可移植優胚的幾率，同時能顯著改善胚胎的著床率，但由于樣本量較少，仍然需要較大的樣本量來進一步證實，為精子中心體的相關研究提供參考。

關鍵詞：

卵胞漿內單精子注射；精子細胞器官形態學檢查；中心體；胚胎

中心體是所有真核生物體內都存在的一種微管結構［1-2］，由典型的9條對稱的粗纖維組成纖維帶，長500nm，直徑275nm［3］。精子形成過程中，精子中心體丟失大部分中心粒周圍的基質（PCM）并保留微管結構［4］。成熟精子在精子頭尾處有兩個相互垂直的中心粒，即近端中心粒和遠端中心粒，后者在精子形成過程中逐步退化［5］。對多數脊椎動物而言，中心體遺傳屬于父源性遺傳［5-6］，精子入卵后，以中心粒為中心逐步形成精星體，同時在精星體的牽引下雌雄原核逐漸靠近并融合。中心粒與卵子中的PCM形成新的中心體，且復制始于原核期，合子的中心體將成為體細胞中心體的前身。對曾進行過ICSI治療且受精失敗的接受輔助生育技術（ART）患者的卵母細胞研究后發現，受精受阻可能是因精子中心體功能異常所致［8］，由此可見精子中心體在受精過程中扮演著極其重要的角色［9］。為此，需要研究者進行有關精子中心體功能的相關研究。2002年，Nakamura等［10］利用不同中心體結構異常的精子注射入卵母細胞來評估其功能，研究結果認為受精失敗可能是精子中心體功能異常所致。導致輔助生育治療患者受精失敗的影響因素較多，其中纖維鞘異常（DFS）是一種很少見的畸形，DFS的精子喪失其運動能力以及精子中心體異常都會導致受精失敗［11］。隨著顯微鏡技術的不斷發展，精子形態對于輔助生育結局的影響越來越受到業內人士的重視，比如精子頭部空泡、精子中段形態等。那么，精子中段形態與其中心體功能的關系以及不同中段形態是否對輔助生育結局產生影響等這些問題引起了我們的關注，并希望通過本實驗檢驗MSOME技術能否通過挑選某種中段形態的精子進行顯微注射，從而獲得更好的助孕結局。本研究利用精子放大系統將精子放大6000倍觀察后，按照精子中段形態將這些精子分為3組A組：1≤a/b≤1.2；B組：a/b≥1.5；C組：其他形態不規則（a/b表示精子中段近端直徑/遠端直徑），并將每組精子分別注射入卵后觀察卵子的正常受精情況、胚胎發育情況和胚胎著床情況，這是國內首次對ART患者嘗試從精子形態學角度評估精子中心體功能，以及精子中段形態對胚胎發育的影響。

1資料和方法

1.1資料

1.1.1研究對象觀察2014年1~11月在成都錦江婦幼保健院行ICSI治療的57例患者（含9例重復周期）。患者促排卵方案為我院標準方案。我院行ICSI患者的指征［12］：（1）嚴重少、弱、畸精子癥；（2）不可逆的梗阻性無精子癥；（3）生精功能障礙（排除遺傳缺陷疾病所致）；（4）男性免疫性不育；（4）體外受精失敗；精子頂體異常。

1.1.2研究對象分組57例研究對象的精子標本按照MSOME高倍鏡（×6000）觀察下中心體形態進行分組。高倍鏡下觀察到精子的中段形態可分為3組：A組：1≤a/b≤1.2；B組：a/b≥1.5；C組：其他形態不規則（a/b表示精子中段近端直徑/遠端直徑）（圖1）［14］。1.2方法1.2.1卵母細胞的采集與處理標準方案：黃體中期肌注GnRHa0.05mg（達必佳，FERRING,Swiss），14d后rFSH150~300U刺激卵巢（果納芬，Merck，Germany），隨后B超監測卵泡發育情況，優勢卵泡≥18mm后，肌注HCG250mg（艾澤，Merck，德國），36h后B超下經陰道穿刺取卵。取卵至少2h后，利用透明質酸酶（Hyaluronidase，80U/mL，Sage，USA）脫顆粒細胞后，置于微滴（G-IVF，Vitrolife，Swedish）中培養，并將培養皿放置于37℃、6%CO2的培養箱（ThermoScientificForma3110，USA）。

1.2.2精子的處理患者精液采用梯度離心法或直接離心法處理，處理后的精子與精子緩沖液（spermrinse，Vitrolife，Swedish）混勻，放入37℃、6%CO2的培養箱（ThermoScientificForma3110，USA）中備用。

1.2.3低倍鏡下挑選精子過程將處理后的精液吸取少許加入注射皿中的聚乙烯吡咯烷酮（PVP）或緩沖液液滴里，然后在400倍顯微鏡（NIKONTE-2000U，日本）下挑選精子形態正常的精子（挑選時主要觀察指標：精子頂體形態、頭部形態、頸部形態及頸部液滴、尾部形態，要盡量挑選前向運動的精子，如果死精子較多時可選微動精子或尾部彎曲的精子），觀察到所要挑選的精子后，用注射針在精子尾部靠近頭部的1/3處迅速制動（當看到精子尾部明顯折痕時，表示制動完成），隨后，從尾部吸入被制動的精子放置在PVP標記過的位置，待下一步精子放大系統觀察所挑選精子。

1.2.4精子放大系統精子在低倍鏡下挑選好后，利用精子放大系統對精子進行再次放大觀察［13］并拍照，然后測量精子中段形態（分A、B、C3組）［14］（圖2）。再次放大觀察過程中不會對患者精子造成任何損傷，另外觀察結束后依然按照低倍鏡下挑選好的精子進行注射，隨后根據注射順序進行單獨培養。

1.2.5胚胎培養及質量評估本實驗室胚胎培養均置于37℃、6%CO2中進行序貫培養（卵裂期胚胎用G-1/囊胚用G-2，Vitrolife，Swedish）。注射后16~20h觀察卵子受精情況（兩原核視為正常受精）。D3胚胎參考WIH［15］評分法，囊胚參考Gardner［16］評分法來對患者胚胎進行評分。

1.2.6胚胎移植與妊娠結果判斷患者移植胚胎后14d尿檢hCG，陽性患者2周后行陰道超聲檢查，發現宮內孕囊則判定為臨床妊娠。

1.3統計學分析實驗結果采用SPSS21.0軟件進行統計學分析，計量資料用均數±標準差，采用單向方差分析，計數資料百分率采用R×C表卡方檢驗，以P<0.05為有統計學意義。

2結果

2.1不同中段形態的精子與胚胎發育不同中段形態的精子注射入卵后，A，B，C3組中正常受精率、D3優胚率、可用囊胚率、胚胎冷凍率均無顯著性差異（P>0.05，表1）。

2.2不同中段形態的精子注射入卵后胚胎著床情況研究結果表明，D3移植優胚率和胚胎著床率具有顯著性差異（P<0.05，表2）。

3討論

部分哺乳動物（比如豬、人等［21-22］）已被證實中心體的遺傳屬于父源性遺傳。對于人類而言，男性精子在形成的過程中，初始精原細胞中典型的中心體結構經過逐步降解以及較為復雜的修飾作用后，最終成熟精子中僅僅保留了近端中心粒［22］，當卵母細胞被精子激活后，排出第二極體，精子近端中心粒與卵子胞質中的中心體基質進行重組，此時以精子頸部中段的中心粒為中心形成精星體［19-21］，在精星體的牽引下，雌雄原核逐漸靠近最終融合形成受精卵。中心粒在原核期開始復制后均分至第1次胚胎分裂的紡錘體兩極，合子的中心體是胚胎、胎兒和成年體細胞中心體的前身［15］。本文中，不同中心體形態的精子注射入卵后，盡管統計學差異不顯著，但從數據上看存在著一定的差異，中心體形態較差的精子注射后，正常受精率較低，僅為63.5%。因此，精子中心體對于卵母細胞的正常受精，精星體的形成以及雌雄原核的形成起著關鍵性的作用。隨著對精子形態研究的不斷深入，掃描電鏡下觀察精子給了我們很多有趣的提示-精子形態和內部結構也許存在某種關聯，因為內部結構異常往往伴隨著形態異常，比如圓頭精子，當對其內部遺傳物質穩定性進行相關研究時證實圓頭精子多表現出紊亂的染色質狀態以及異常的染色體結構［14,17-18］。同時，有研究發現低倍鏡（×400）下精子活力正常，但高倍鏡（×6000）下觀察到精子中段形態呈錐形時，該類精子注射入牛卵后精星體形成率較低，選擇中段較直的精子，有利于改善精星體的形成率［17］。該結論與本研究相吻合，本文對精子中心體不同形態注射入卵后，觀察卵子的受精情況，結果顯示，精子中心體形態較好的AB組精子注射后，受精率分別為80%和73%，明顯高于C組的受精情況。從這些研究推測精子中段形態異常可能會導致精子中心體功能異常。研究精子中心體功能最好的方法是將不同精子注射入卵，觀察精星體的形成，該類試驗多用哺乳動物的卵子進行研究。Rawe等［23］利用不育男性精子注射入牛卵，每條精子在注射入卵后均在頸部形成精星體，隨后形成多個有絲分裂的紡錘體，但是未見多極紡錘體。而孤雌激活的牛卵子中未見微管結構，由此推斷當人精子注射入牛卵時，精子中心體可能對受精過程發揮極其重要的作用。

另外，研究者對圓頭精子患者和DFS的不育患者精子與有生育能力的男性精子相比，圓頭精子癥患者形態異常的精子注射入卵后精星體形成率低于后者，同時還觀察到精子中段形態異常的精子注射入卵后所形成的中心體排列絮亂［24］。上述的研究表明，精子中心體功能可能與精子中段形態存在某種相關性。形態較差的精子其中心體功能可能存在異常。另外有研究者利用形態選擇性胞漿內單精子注射技術（IMSI）對精液參數正常者、少弱精子癥患者、少弱畸精子癥患者精子進行形態挑選后檢測精子中DNA碎片率，結果發現3組分別為21.1%、31.8%和54.1%，結果提示精液參數和精子DNA碎片率相關［24］。Him等［25］將少弱畸精癥患者分為兩組，一組進行傳統的ICSI治療；另一組將在MSOME放大系統下對精子進行更細微的形態學觀察，挑選出形態最佳的精子進行注射。最終對IMSI和ICSI治療后的助孕結局進行對比分析，結果發現二者受精率無顯著性差異，臨床妊娠率和著床率均差異顯著。與此同時本文中不同中心體形態的精子注射后，移植優質胚胎率和胚胎著床率均差異顯著（P<0.05）。這些研究結果提示我們，從精子形態學角度出發，精子的形態多樣性可能與某些內部結構的不同狀態存在緊密聯系，當利用更加精確的精子挑選系統對精子進行觀察及分類后，將不同形態的精子注射入卵母細胞會得到不同的助孕結局。從而本研究中并未對患者進行篩選，僅僅從精子中段形態角度考察其中心體功能，并最終觀察不同中段形態對助孕結局是否產生影響。研究結果顯示，精子中段形態不規則的精子，注射入卵后正常受精率有所下降，尤其是精子中段形態不規則的精子，其正常受精率僅為63.5%，由此可推斷精子中段形態的變化會影響精卵的正常受精，本研究由于樣本量較少，這一結果并沒有表現出顯著性差異，我們需要進一步累計較多的臨床數據再進行進一步分析。

精子中心體不僅在受精過程中起著關鍵作用，Yoshinmoto等［26］用不育患者的精子注入牛卵母細胞中來評估精子中心體功能，發現早期的胚胎卵裂及后期的種植、妊娠過程與中心體功能存在聯系，正常情況下胚胎進行對等分裂，分裂中每個卵裂球都含1個中心體和1套染色體，當中心體功能異常時，胚胎發生不均等分裂，可能有1或2個卵裂球無細胞核，這也表明中心體功能對早期胚胎的分裂發育也產生一定的影響。早起胚胎發育過程中卵裂球的分裂往往呈幾何倍數增長，但是在日常胚胎實驗室工作中經常會觀察到D2胚胎的卵裂球數呈奇數，其中部分卵裂球中并未觀察到原核，該現象有時在囊胚階段也能觀察到［27-28］。Kim等［29］研究表明，將患者精子行ICSI注入卵中精星體的形成始于精子頸部，如果注射精子僅僅是精子頭部時，精星體的形成始于卵子，此時形成的胚胎類似于孤雌激活的胚胎。本研究中精子中心體形態為C組的D3優胚率和囊胚形成率分別為18.8%和9.09%，均低于A、B兩組，盡管C組中正常受精率為63.5%，但是后續的胚胎發育潛能欠缺，同時移植3例患者中9枚胚胎均來自C組的精子注射入卵形成胚胎，無一例胚胎著床。研究結果提示我們是不是精子中心體形態除了影響精星體的形成外，參與的后續的胚胎發育情況，這一結論也驗證了Yoshinmoto等學者的推斷［26］。由于樣本量較少，對與該假設仍然需要進一步的積累并證實。可以肯定的是利用精子放大系統選擇那些精子中段較直的精子注射入卵，能獲得較為理想的正常受精率。

作者：孟祥黔 龔藝 黃軍 曾永梅 全松 鐘影 單位：四川省成都市錦江區婦幼保健院生殖醫學中心 南方醫科大學南方醫院婦產科生殖醫學中心