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《世界中醫藥雜志》2015年第一期

1常用技術概要

1.1冰凍切片

1.1.技術特點冰凍切片是將新鮮組織快速冷凍后再進行切片。制片周期較石蠟切片短，可用于組織結構的快速觀察，也可用于一些不適于石蠟切片制備的組織的觀察，如脂肪組織。冰凍切片也可以進行各種染色（圖2）。石蠟切片和冰凍切片均可用光學顯微鏡進行觀察。

1.1.2應用舉例團隊對糖尿病并發癥有專門的研究。KKAy小鼠是一種自發糖尿病模型小鼠，利用小鼠觀察了中藥對糖尿病并發癥的治療作用。HE染色的石蠟切片顯示糖尿病小鼠肝臟結構紊亂，肝細胞胞漿有明顯空泡，肝細胞有脂肪變性。進而利用冰凍切片進行油紅O染色，明確空泡內確為脂肪。研究結果顯示能改善糖尿病小鼠肝臟結構，對糖尿病造成的肝臟損害具有一定的保護作用［3］。

1.2電鏡超薄切片

1.2.1技術特點光學顯微鏡可觀察細胞的結構，電子顯微鏡則能觀察亞細胞結構。常用的有透射電鏡和掃描電鏡技術，前者用于觀察細胞內的超微結構，如線粒體、內質網等；后者用于觀察樣本表面的變化，如支氣管的微絨毛（圖3）。超薄電鏡切片需要使用電子顯微鏡進行觀察。

1.2.2應用舉例我們團隊研究了黃芪注射液和葛根素注射液對2型糖尿病小鼠腎臟病理改變的影響，在早期光鏡僅觀察到腎小球體積增大，腎小管上皮細胞有明顯空泡，未見其他改變。但通過電鏡觀察，發現腎小球基底膜有局灶性增厚，系膜基質、系膜細胞增多，間質細胞增生。說明在早期已經出現了輕微的硬化性改變，且中藥可以減輕這些病理損害［4］。利用電鏡技術，我們還觀察了中藥對糖尿病模型小鼠腦微血管病變的影響，通過電鏡觀察，顯示模型組小鼠神經細胞核染色質疏松，線粒體腫脹，粗面內質網縮小，核糖體減少，經過中藥治療后上述改變減輕。說明中藥改善2型糖尿病動物模型KKAy小鼠腦微血管病變［5］。

1.3組織化學技術

1.3.1技術特點組織化學是運用物理學、化學、免疫學、分子生物學等原理與技術，對組織與細胞的化學成分、化學反應及其變化規律進行定性、定位和定量研究的科學，是介于這些學科之間的一門邊緣科學。其中在實際工作中較常用的是免疫組織化學技術。

1.3.2應用舉例團隊在復制大鼠慢性胃潰瘍模型的基礎上，通過免疫組化的方法檢測增殖細胞核抗原（PCNA），對半夏瀉心湯進行拆方研究。結果表明，半夏瀉心湯及其拆方各組均有不同程度的調節胃黏膜細胞增殖作用。拆方各組中，部分藥組之間呈協同的作用趨勢，部分藥組之間呈制約趨勢。綜合評價其總體療效，以全方組最佳，從而印證了仲景組方的合理性和科學性［6］。

1.4細胞培養技術

1.4.1技術特點從組織中獲取細胞并使其在體外生長稱為原代培養。也可購買細胞株直接進行體外培養。培養的細胞是進行各種醫學實驗的良好材料。由于細胞種類單一，可用于觀察特定細胞對刺激因素的反應，也可進行較深入的機制研究。但由于是體外培養，細胞的反應與體內存在一定的差異。

1.4.2應用舉例我們團隊體外培養了人腎小管上皮細胞，并在此基礎上研究中藥對腎小管上皮細胞轉分化的影響。發現轉化生長因子（TGFβ1）可誘導體外培養的人腎小管上皮細胞發生轉分化，中藥可以阻斷或逆轉上皮細胞的轉分化［7］。我們還研究了中藥對人近曲小管上皮細胞細胞增殖的影響，以及對高糖誘導后細胞內GRP78表達的影響。結果顯示，葛根素可促進細胞增殖，并且可通過增加內質網伴侶蛋白GRP78的表達量，以促進蛋白質正確折疊，來恢復細胞的穩態，從而減輕糖尿病時腎臟的結構損傷［8］。

2應用體會

以上這些基本的形態學技術可以與經方的研究緊密結合起來，為經方的實驗研究提供可靠的技術保障。在以下幾方面，形態學技術都可以為經方的研究提供技術保障。

2.1形態學技術可以客觀判定疾病模型的成功與否由于經方是在臨床實踐中形成的經典方劑，治療的對象是各種疾病。因此，復制多種疾病的動物模型，并在此基礎上研究經方的治療效果是經方研究中的基礎工作。動物的疾病模型復制是否具備與人類疾病相似的改變，直接決定了后續的研究是否能繼續，而很多動物的疾病模型病變的判斷需要依賴形態學技術，在一些疾病中，形態學改變對于疾病的診斷起關鍵作用。如真武湯、五苓散、豬苓湯等均可用于治療糖尿病腎病，若在經方的研究中結合形態學技術則能更客觀，研究結果也更容易被接受［9］。糖尿病腎病的主要形態學表現為早期腎小球肥大，晚期為腎間質和腎小球纖維化。我們以往的研究發現，2型糖尿病腎病KKAy小鼠具有典型的糖尿病腎病的形態改變，黃芪可減輕該小鼠的腎臟病理損害，明確其對糖尿病腎病有治療作用。

2.2形態學技術可用于經方治療疾病的機理研究在實驗研究中，除了觀察經方對多種疾病的治療效果，更重要的是揭示其作用機制和作用環節，進而指導今后的中醫臨床。我們團隊研究了TGFβ1信號通路在糖尿病腎病發病中的作用及其中藥的作用位點。由于在一個器官中有多種組織，僅通過分子生物學手段研究某些因子的表達情況，只能說明在器官中的平均表達水平，無法確定其在某一特定細胞或組織中的表達。如能將形態學技術與分子生物學技術結合起來，既能確定某一種因子的表達高低，又能將這種表達的改變定位，對于治療的作用機理的研究具有重要意義。我們曾將免疫組織化學技術與臨床生化指標檢測、分子生物學技術結合起來，不但能說明中藥的治療效果，還能進行機制研究［11］。除了進行在體實驗，還可以在體外培養細胞，利用細胞培養技術進行較深入的機制研究。我們團隊發現中藥對糖尿病腎病小鼠早期腎臟的內質網應激反應有一定的影響，為了確定中藥是否對腎小管上皮細胞的內質網應激有同樣的作用，就利用體外培養的腎小管上皮細胞—HK2細胞，經過高糖刺激后，觀察中藥對該細胞內質網應激的影響。發現高糖確實能誘導HK2細胞產生內質網應激，中藥對過度的內質網應激有一定的抑制作用［8］。

2.3形態學技術可用于經方的配伍研究通過拆方研究，確定最佳的配伍比例，可以為臨床醫生提供可靠的實驗依據。有實驗通過復制臨床關節炎疾病的大鼠模型，比較了大鼠造模前后不同配伍比例的芍藥甘草湯的治療效果，發現芍藥甘草1∶1配伍時的止痛作用起效明顯早于其他配伍比例，證實了芍藥甘草湯原方配伍應用的科學性和合理性。同時應用了免疫組織化學的方法發現TRPV1（瞬時受體電位通道香草醛亞型1，transientreceptorpotentialvanilloidtype1）通道蛋白的表達可能是芍藥甘草湯臨床上發揮止痛作用的分子機制之一，同時也表明干預該靶點可能是芍藥甘草湯中芍藥和甘草1∶1配伍止痛效應最大化的分子基礎［12］。為研究半夏瀉心湯的配伍規律，將該方拆成辛開藥（半夏、干姜，X）組，苦降藥（黃芩、黃連，K）組，甘補組（人參、炙甘草、大棗，G）組，并進行交叉組合成XK、XG、KG組，及全方組（Q）。復制大鼠慢性胃潰瘍模型后，分別給予上述各組藥物治療，比較各組大鼠血清胃泌素的水平。結果表明X、K、G、KG組藥物對胃泌素無明顯影響；XK、XG組藥物對胃泌素有明顯影響，其中XG組的作用與Q組相近。上述結果提示：不同辛味藥物之間的配伍，直接影響其生物效應［13］。這一實驗結果為性味配伍理論提供了實驗支持依據。

2.4形態學技術可用于經方及中醫基本理論的研究我們團隊在復制大鼠COPD模型的基礎上，觀察了宣肺中藥對其的影響，發現應用宣肺中藥從肺論治COPD，肺組織病理改變減輕的同時伴見腸組織病理改變呈改善趨勢，從側面印證了中醫“肺合大腸”臟腑相關理論，肺－腸之間存在著一定的相關性及互動調節現象。該項研究即使用了形態學技術，首先證實了模型大鼠具備了COPD的基本病理變化和宣肺中藥對此病理改變有減輕作用，進而利用分子生物學技術證實宣肺中藥提高了腸組織IFNγ、降低了IL10mRNA的表達，一定程度上證實了肺－腸之間存在著一定的特異性互動效應機制，為探討“肺合大腸”中醫臟腑相關理論奠定基礎［14］。以上僅列舉了一些在經方研究中用到的形態學技術，在今后的工作中，可以在更多領域使用形態學技術，形態學技術本身也隨著科技的發展不斷豐富。古老經方的研究與不斷發展的形態學技術相結合，可以從不同角度和側面闡釋經方的組方理念，總結其治療原則，讓更多的學者掌握經方的科學內涵，以更方便臨床醫生在實踐使用經方。

作者：王謙李姝玉許紅高譽珊張淑靜李宇航單位：北京中醫藥大學基礎醫學院