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摘要：目的探討lncRNACCAT1在肝細胞肝癌中的表達及其臨床意義。方法采用熒光定量PCR檢測檢測96例肝癌癌灶組織及癌旁組織中lncRNACCAT1的表達情況，并分析與各臨床病理因素以及患者預后的相關性。結果lncRNACCAT1在肝癌癌灶組織表達升高;肝癌癌灶組織中lncRNACCAT1表達量和門靜脈癌栓、TNM分期等因素相關。進一步生存分析發現lncRNACCAT1表達陽性者術后平均生存時間(32．1個月，95%CI:26．3～38．0個月)明顯短于陰性患者(47．2個月，95%CI:42．5～52．0個月)，差異有統計學意義(χ2=7．607，P=0．006)。并且lncRNACCAT1表達是肝癌患者總體生存的獨立危險因素。結論lncRNACCAT1表達在肝癌發生、發展中發揮重要作用;lncRNACCAT1表達是肝癌患者的獨立預后因素。

關鍵詞：長鏈非編碼RNACCAT1肝細胞肝癌生存分析

肝癌是世界范圍內的高發惡性腫瘤之一，盡管隨著現代醫療技術的進步，肝癌的診療手段已漸趨成熟，但是其術后5年復發率仍高達80%，每年約有超過600000人死于肝癌，缺乏有效的診療、監測靶點是造成肝癌患者預后低下的原因［1］。長鏈非編碼RNA(longnon－codingRNA，lncRNA)是一組長度＞200個核苷酸、缺少完整的開放閱讀框和無蛋白質編碼功能的RNA。近年來研究顯示，lncRNA具有各種不同的生物學功能，作為抑癌或致癌基因參與腫瘤的發生、發展。lncRNACCAT1被證實高表達于結腸癌、胃癌、膽囊癌，然而在肝細胞肝癌中的表達情況仍不清楚［2～4］。本研究中筆者采用熒光定量PCR法檢測肝癌組織中lncRNACCAT1中的表達情況，并分析其與臨床病理因素的相關性。

材料與方法

1．標本來源:

收集2005年9月～2010年10月在溫州醫科大學附屬浙江省臺州醫院接受手術治療的96例HCC患者的組織標本(包括癌灶組織及相應癌旁組織)，術后均確診為肝細胞肝癌。腫瘤病理診斷參照世界衛生組織標準、臨床分期標準參照美國癌癥聯合委員會(AJCC)制定的第7版TNM分期標準［5］。術前患者均未接受放化療或其他任何藥物干預。并有完整臨床病理資料(年齡、性別、病理診斷、門靜脈癌栓、酗酒、腫瘤直徑、TMN分期等)。所有患者中位隨訪時間為38．5個月(2．0～60．0個月)，其中57例死于肝癌。為研究lncRNACCAT1的臨床相關性，筆者根據CCAT1表達量將數據平均分為兩組，即CCAT1高表達組和CCAT1低表達組，并對肝癌組織中lncRNACCAT1的表達量與各臨床病理因素的關系進行分析。所有人體標本的研究均事先獲得倫理委員會的批準。

2．實時定量聚合酶鏈反應(real－timePCR)檢測肝癌及癌旁組織中lncRNACCAT1的表達:

采用Tr-izol試劑盒(美國Invitrogen公司，Carlsbad，CA)試劑盒抽提總RNA。采用ABI公司的HighCapacitycD-NAReverseTranscription試劑盒將RNA反轉錄合成cDNA，反轉錄反應:25℃10min，37℃120min，85℃5min，4℃保存。RT－PCR采用ABI公司PowerSYBRGreenPCRMastermix試劑盒及ABI7900HT系統，以GAPDH為內參基因，使用2－△△Ct法計算lncRNACCAT1在肝癌組織相對于癌旁組織的表達量，并根據其表達水平中位數將肝癌患者分為低表達組和高表達組，分析CCAT1表達與臨床病理參數及預后的關系。引物序列如下:CCAT1上游引物:5'－GCCGTGTTAAGCATTGCGAA－3'，下游引物:5'－AGAGTAGTGCCTGGCCTAGA－3';GAPDH上游引物:5'－GAAATCCCATCACCACTTCCAGG－3'，下游引物:5'－GAGCCCCAGCCTTCTCCATG－3'。

3．統計學方法:

實驗結果應用SPSS20．0統計學軟件進行統計分析。不同組間的差異評估采用Student'st－test或χ2檢驗，生存分析用Kaplan－Meier和Log－rank檢驗，多因素分析用COX回歸模型，以P＜0．05為差異有統計學意義。

結果

1．lncRNACCAT1在肝癌癌灶及癌旁組織中的表達:qRT－PCR結果經Student'st－test檢驗提示肝癌組織中lncRNACCAT1較癌旁組織明顯低表達(P=0．000)，見圖1。圖2．肝癌中lncRNACCAT1的表達量與臨床病理因素的關系:lncRNACCAT1的表達量與門靜脈癌栓(χ2=15．229，P＜0．05)及TNM分期(χ2=4．196，P=0．041)具有相關性，而與患者年齡、性別、腫瘤直徑、酗酒等無明顯相關(P＞0．05，表1)。

3．lncRNACCAT1與肝癌患者預后的關系:

對96例肝癌患者進行生存分析。Kaplan－Meier分析顯示:HLA－F陽性患者術后平均生存時間為32．1個月(95%CI:26．3～38．0個月);HLA－F陰性患者術后平均生存時間為47．2個月(95%CI:42．5～52．0個月)。HLA－F陽性患者生存時間短于陰性患者，差異有統計學意義(χ2=7．607，P=0．006，圖2)。COX回歸模型分析肝癌患者預后影響因素，單因素分析顯示:HLA－F表達、TNM分期均是肝癌患者術后生存時間的危險因素。多因素分析顯示HLA－F更是影響肝癌患者術后生存的獨立危險因素(表2)。

討論

長鏈非編碼RNA(longnoncodingRNA，lncRNA)是一群長度＞200bp的RNA，不具有編碼功能，以往認為其是RNA聚合酶Ⅱ的轉錄副產物，不具備生物學功能［6］。但是近些年來研究表明，lncRNA可以在轉錄、轉錄后等不同水平參與下游基因的調控，與腫瘤發生、發展密切相關［6～8］。其可能的作用機制:①按照堿基配對原則，參與mRNA前體修飾;②與蛋白質或miRNA結合，調控相關基因的表達;③招募染色質修飾酶復合物致目標基因區域，參與其表觀遺傳學修飾［9～11］。lncRNACCAT1是一個擁有2628bp的非編碼RNA分子，最早在結腸癌中被發現，位于8q24．21、轉錄因子C－Myc附近，研究表明這是基因突變的高發區［12］。近年來已有研究顯示CCAT1在膽管癌等腫瘤組織中高表達［13～15］，參與腫瘤惡性進展。Jiang等［13］研究發現CCAT1在膽管癌組織中的表達較癌旁組織高，其表達量與組織分化程度、淋巴結侵襲、TNM分期及患者預后相關，是膽管癌患者的獨立預后因素。Zhang等［14］研究顯示CCAT1可通過負調控miR－218－5P促進視網膜母細胞瘤SO－RB50及Y79細胞株的增殖、侵襲、遷徙、并減少凋亡，可作為視網膜母細胞瘤的潛在治療靶點。研究發現，結腸癌患者中lncRNACCAT1和HOTAIR表達升高，有望成為結腸癌篩查指標，提高結腸癌陽性診斷率。筆者采用RT－PCR法分析了lncRNACCAT1肝癌組織中的表達情況，結果發現:①lncRNACCAT1在肝癌癌灶組織中表達升高;②其表達量與患者年齡、腫瘤直徑、漿膜侵犯、TNM分期等無明顯相關，而與門靜脈癌栓和腫瘤數目表現出一定相關性;結合上述兩點，筆者推測lncRNACCAT1高表達可能在肝癌惡性進展中發揮重要作用;③生存分析發現lncRNACCAT1表達陽性患者預后較差，可作為肝癌患者預后的獨立危險因素。總之，筆者研究了lncRNACCAT1在肝癌組織中的表達特點和預后意義，推測lncRNACCAT1表達在肝癌發生、發展中發揮重要作用;并且lncRNACCAT1表達與預后相關，是肝癌患者的獨立預后影響因素，對判斷肝癌患者預后具有重要參考價值。但lncRNACCAT1在人體生理病理中其臨床意義及作用機制等研究剛剛起步，仍需要進一步探索。

作者：陳思思陳霞蔣瓊英徐永富朱昱胡鵬單位：溫州醫科大學附屬浙江省臺州醫院口眼中心