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《中國中醫基礎醫學雜志》2014年第六期

1材料與方法

1.1實驗方法

1.1.1實驗分組動物購進后適應性喂養2d制備CIA模型，成模后根據造模及給藥情況進行隨機分組，分為8組，每組11～12只大鼠，分別為對照組(Ⅰ)、不完全弗氏佐劑組(Ⅱ)、模型組(Ⅲ)、雷公藤多苷組(Ⅳ)、醋酸潑尼松龍組(Ⅴ)、滑膜炎顆粒大劑量組(Ⅵ)、中劑量組(Ⅶ)、小劑量組(Ⅷ)。

1.1.2主要試劑配制Ⅱ型膠原配置:取適量牛Ⅱ型膠原溶液逐滴加入等容積的不完全弗氏佐劑中，勻漿器分散使其充分乳化，以滴入水中不擴散為標準，配成濃度為1mg/mL的乳劑，以上操作均在冰浴中進行。

1.1．3CIA模型的制備參照文獻［2］，取Ⅱ型膠原乳劑注射于大鼠尾根部皮下，0.2ml/只。7d后加強免疫1次，0.1ml/只注射于大鼠尾根部皮下;對照組注射生理鹽水，佐劑組注射不完全弗氏佐劑。造模成功后，按足趾腫脹度調整各造模組動物，剔除未成模大鼠。

1.1.4給藥方法加強免疫6d后開始給藥，對照組、不完全弗氏佐劑組及模型組給予等體積純水。雷公藤多苷片9.45mg/kg，醋酸潑尼松龍2.70mg/kg，滑膜炎顆粒分為大、中、小3個給藥劑量，分別為9.68g生藥/kg、4.84g生藥/kg、2.42g生藥/kg。給藥體積1mL/100g，每天1次，連續灌胃給藥36d，每周監測體質量1次。

1.1.5足趾容積測定致炎前在大鼠后肢踝關節上方0.5cm處劃一水平標志線，用足趾容積測量儀測量其容積，左手握住大鼠前肢，右手捉住大鼠后膝關節處使其后腳伸直，以儀器托手架做依托，緩慢放入測量杯內，當水平面與鼠足部測量標線重疊時按下測量開關。加強免疫后每3d測1次足趾容積，計算關節腫脹度。腫脹度=(造模后左后足容積+造模后右后足容積)－(造模前左后足容積+造模前右后足容積)。

1.1.6關節炎指數評分給藥開始進行關節炎指數評分，每3d1次。關節炎指數評分標準:前爪:關節的炎癥(無0分，有1分);后爪:腫脹(無0分，輕度1分，中度2分，重度3分);指掌關節變形(無0分，有1分)，前爪和后爪指(趾)紅腫(無0分，有1分);跖骨變形(無0分，有1分)［3，4］。

1.1.7踝關節病理形態改變末次給藥后24h處死動物，取踝關節固定于10%的福爾馬林溶液中，脫鈣后常規石蠟包埋、切片、HE染色觀察踝關節形態學改變。根據關節各部位病變輕重程度建立定量評分標準［5］:依次定量為1分(輕度或少量)、2分(中度或多量)、3分(重度或大量)，無病變組織為0分。累加各單項評分即為損傷總分，得分越高即表明損傷程度越嚴重，并對各單項評分及總分進行組間比較。

1.1.8流式細胞儀檢測大鼠T細胞亞群按試劑盒說明操作，末次給藥后24h腹主動脈取血處死大鼠，收集EDTA抗凝大鼠全血200μL，分別加入APC標記的CD3抗體、PE標記的CD4抗體和FITC標記的CD8抗體，室溫避光孵育30min，加入2.0mL裂解液輕輕振蕩，室溫孵育15min，200Xg，離心5min棄上清，加入2mL含1%胎牛血清的PBS重懸血細胞懸液，200Xg，離心5min棄上清，重懸細胞懸液于0.5mLPBS中，上機檢測。

1.2統計學方法

應用GraphPadPrism4.0統計軟件進行分析，計量資料以均數±標準差(x珋±s)表示，組間比較采用單因素方差分析，P＜0.05為差異有統計學意義。

2結果

2.1滑膜炎顆粒對CIA大鼠體質量的影響圖1顯示，造模后隨著給藥時間延長，各組動物體質量均增加，但模型組及各給藥組體質量增加較空白對照組緩慢，與對照組比較差異有統計學意義(P＜0.01)。各給藥組體質量高于模型組，但與模型組比較差異無統計學意義。

2.2滑膜炎顆粒對CIA大鼠足趾腫脹度影響測量造模前后大鼠足趾容積比較各組大鼠足腫脹情況，結果表明加強免疫后6d，各造模組動物足趾出現不同程度腫脹，與對照組比較差異有統計學意義(P＜0.01)。隨著給藥時間延長，所有大鼠足腫脹程度均有不同程度減輕，各給藥組動物足腫脹程度較模型組減輕更明顯。其中Ⅳ組TGT組給藥12d時，與模型組比較差異有統計學意義(P＜0.05);Ⅴ組醋酸潑尼松龍組于給藥6d起，足趾腫脹度減輕明顯，與模型組比較差異有統計學意義(P＜0.01);Ⅶ組滑膜炎中劑量組給藥后15d、18d、24d、27d、30d、33d與模型組比較差異有統計學意義(P＜0.01或P＜0.05，圖2)。

2.3滑膜炎顆粒對CIA大鼠關節炎指數影響關節炎指數評分結果顯示，對照組、佐劑組大鼠關節無改變，各造模組動物關節紅腫、變形，隨著給藥時間延長各組關節紅腫情況逐漸減輕，其中Ⅳ組雷公藤多苷片組給藥12d、21d關節炎指數評分于模型組，與模型組比較差異有統計學意義(P＜0.01，P＜0.05);給藥36d關節炎指數評分高于模型組，與模型組比較差異有統計學意義(P＜0.01)。Ⅴ、Ⅵ、Ⅶ組關節炎指數評分均低于模型組，其中Ⅴ組醋酸潑尼松龍組于給藥6d開始，關節指數評分與模型組比較差異有統計學意義(P＜0.01);，Ⅵ組滑膜炎大劑量組于給藥12d、21d、24d關節炎指數評分與模型組比較，差異有統計學意義(P＜0.05或P＜0.01);Ⅶ組于給藥12d、21d、24d、30d與模型組比較，差異有統計學意義(P＜0.01，圖3)。

2.4滑膜炎顆粒對CIA大鼠踝關節病理形態學變化的影響圖4顯示，正常對照組、不完全佐劑組關節及滑膜結構正常，關節軟骨表面光滑平整，無炎細胞及淋巴細胞浸潤現象，無血管翳形成。模型組關節腔明顯變窄，TPT、潑尼松龍和滑膜炎各劑量組出現滑膜、軟骨、纖維組織及小血管增生，炎性細胞浸潤，但較模型組有明顯改善(圖4)。根據關節各部位病變輕重程度建立定量評分標準(如表1)，各給藥組病理損傷與模型組比較差異有統計學意義。

2.5滑膜炎顆粒對CIA大鼠T細胞亞群影響表2顯示，流式細胞儀檢測各組大鼠外周血T細胞亞群的變化，結果顯示模型動物和各給藥組CD3+T(TT)細胞總數在外周血T細胞所占的百分比與正常對照組比較差異無統計學意義。各組Th細胞在CD3+T細胞中所占百分比顯著高于正常對照組，Ⅲ、Ⅴ、Ⅷ組與對照組比較，差異有統計學意義(P＜0.01，P＜0.05);滑膜炎顆粒各給藥組Th細胞百分比均較模型組有所下降，但與模型組比較無統計學意義;各組大鼠Tc細胞在CD3+T細胞中所占比例顯著低于正常對照組，Ⅲ、Ⅴ、Ⅶ、Ⅷ組與對照組比較差異有統計學意義(P＜0.01，P＜0.05);各組大鼠Th/Tc的比值明顯高于對照組，Ⅲ、Ⅴ組與對照組比較差異有統計學意義(P＜0.01);滑膜炎顆粒各給藥組Th/Tc比值均較模型組有所下降，但差異無統計學意義。

3討論

類風濕關節炎屬于中醫學“痹證”范疇，因陽氣受損、腠理空虛、衛氣不固、風寒濕邪乘虛侵襲肌膚，致氣血凝滯、經絡痹阻，從而導致患部腫脹疼痛，關節僵硬變形。在RA中滑膜的持續性增生、軟骨和骨組織的破壞是其重要的病理學特征。目前RA動物實驗研究中，主要采用佐劑性關節炎模型(AA)和CIA模型。模型大鼠關節病理觀察顯示，CIA大鼠滑膜增生、軟骨破壞、炎細胞浸潤程度較AA大鼠明顯，持續時間也較AA模型長，與RA臨床特點更接近［1］。故本實驗采用Ⅱ型膠原大鼠尾根部注射，制備CIA模型。造模后大鼠體質量增長緩慢，較對照組體質量明顯降低，加強免疫后6d，大鼠出現關節紅腫、活動受限，隨著病程進展，受累關節出現不同程度變形，提示CIA模型成功。糖皮質激素在RA急性期能迅速減輕關節疼痛和腫脹癥狀。雷公藤多苷具有抗炎及免疫抑制作用，廣泛用于RA的治療［6］，故本實驗選取醋酸潑尼松龍與雷公藤多苷片作為西藥和中藥陽性對照藥物，二者對CIA模型呈現出較好的治療作用。然而隨著給藥時間延長，雷公藤多苷片組關節變形改善較差，故給藥36d時關節炎指數評分高于模型組。滑膜炎顆粒功效清熱利濕、活血通絡，用于治療急、慢性滑膜炎，其中夏枯草、薏苡仁、防己、澤蘭、黃芪促進積液吸收;土茯苓、豨薟草、絲瓜絡改善關節活動度;川牛膝、丹參、當歸消腫止痛;女貞子、功勞葉強壯關節［7］。本實驗滑膜炎顆粒各劑量組能夠改善足趾腫脹程度和關節炎指數評分，高劑量組(9.68g生藥/kg)、中劑量組(4.84g生藥/kg)與模型組比較差異有統計學意義，小劑量組也呈現較好的治療趨勢。踝關節病理切片顯示，模型組關節腔明顯變窄，軟骨、纖維組織及小血管增生，炎性細胞浸潤，滑膜炎顆粒各給藥組能夠不同程度改善上述癥狀，踝關節病理形態變化評分低于模型組，表明滑膜炎顆粒對RA滑膜損傷具有較好的治療作用，與整體足趾腫脹程度和關節炎指數的檢測結果相一致。

T淋巴細胞是機體免疫系統中的主要調節及效應細胞，根據其表面標志不同成熟T細胞可分為2個亞類，即CD4+T細胞和CD8+T細胞。CD4+T細胞按其功能可分為輔助性T細胞(TH)和遲發型超敏性T細胞(TDTH)，前者為調節性T細胞，后者為效應性T細胞。CD8+T細胞也是不均一的細胞群，按其功能分為抑制性T細胞(TS)和殺傷性T細胞(TC)，前者為調節性T細胞，后者為效應性T細胞。近年來，分泌白介素17的CD4+T細胞亞群(TH17細胞)被認為與類風濕關節炎的發病密切相關，RA患者體內以CD3+CD4+T淋巴細胞亞群異常增加為特征，異常活化的CD3+CD4+T淋巴細胞通過釋放大量促炎性細胞因子加速病灶部位的組織損傷［8］。本研究各造模組大鼠Th細胞百分比、Th/Tc均高于空白對照組，Tc細胞百分比均低于對照組，與文獻報道相一致。滑膜炎顆粒各給藥組Th細胞百分比、Th/Tc均低于模型組，Tc細胞百分比均高于模型組，說明滑膜炎顆粒對CIA大鼠關節損傷治療作用與降低Th細胞百分比相關。而潑尼松龍組Th細胞百分比、Th/Tc與模型組大體相當，說明其治療RA作用與Th細胞可能不相關。總之，本實驗應用CIA模型動態監測滑膜炎顆粒抗類風濕作用，并通過流式細胞儀深入探討其作用效應與T細胞亞群的相關性，為臨床應用滑膜炎顆粒治療RA滑膜損傷提供了實驗參考，然而其作用機制有待進一步研究。

作者：孫麗華張志偉張華健周艷華崔海峰于友華王正品孫明杰單位：中國中醫科學院醫學實驗中心中藥注射劑新藥開發技術國家地方聯合工程實驗室 河北省中藥注射液工程技術研究中心神威藥業集團有限公司