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摘要：目的了解深圳市光明新區(qū)諾如病毒疫情暴發(fā)的病原體基因分型情況和分子流行病學(xué)特征。方法收集2016年12月至2017年3月感染性腹瀉暴發(fā)疫情患者的肛拭子標(biāo)本，通過熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）檢測(cè)諾如病毒核酸，陽(yáng)性標(biāo)本采用巢式PCR擴(kuò)增諾如病毒VP1基因區(qū)（ORF1－ORF2），PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖電泳鑒定后進(jìn)行測(cè)序分析。結(jié)果9起暴發(fā)疫情共檢測(cè)標(biāo)本101份，諾如病毒陽(yáng)性標(biāo)本共54份，總陽(yáng)性率為53．47％，其中GⅡ型標(biāo)本52份，GⅠ型標(biāo)本1份，GⅠ和GⅡ型混合感染標(biāo)本1份。測(cè)序成功獲得48份陽(yáng)性標(biāo)本GⅡ型諾如病毒VP1基因序列，47份為GⅡ．P16／GⅡ．2亞型，其中45份與2016年中國(guó)香港株（KY771081）和中國(guó)廣東株（KY485113）同源性最高，2份與2017年中國(guó)江蘇株（KY806301）和2016年泰國(guó)清邁株（MF972308）同源性最高；1份為GⅡ．P7／GⅡ．6亞型，與2014年中國(guó)臺(tái)灣株（KM267741）同源性最高。結(jié)論2017年該區(qū)諾如病毒疫情暴發(fā)的主要型別為GⅡ型，優(yōu)勢(shì)流行株為GⅡ．P16／GⅡ．2亞型。

關(guān)鍵詞：諾如病毒；疫情；流行特征；分子分型

諾如病毒為杯狀病毒屬的單鏈RNA病毒，是引起全球急性腸胃炎最重要的病原體之一［1］。諾如病毒共分為GⅠ～GⅦ7個(gè)基因組和30個(gè)基因型［2］。自2014年11月起就有報(bào)道顯示，在中國(guó)廣東、江蘇和浙江，以及日本等亞洲地區(qū)均有新型諾如病毒GⅡ．17引起的疫情暴發(fā)，對(duì)世界公共衛(wèi)生造成極大的影響［3－7］。從2016年底至今，深圳地區(qū)不同區(qū)域連續(xù)暴發(fā)諾如病毒疫情引起了相關(guān)衛(wèi)生部門的重視。本研究對(duì)2016年12月至2017年3月光明新區(qū)幼兒園和小學(xué)因腹瀉的患者進(jìn)行諾如病毒GⅠ／GⅡ／A組輪狀病毒檢測(cè)，檢測(cè)陽(yáng)性標(biāo)本進(jìn)一步測(cè)序分型，以了解造成疫情的主要病原體和腹瀉病毒的分子特征，以期對(duì)深圳地區(qū)諾如病毒暴發(fā)的流行狀況和疫情防控提供科學(xué)依據(jù)，現(xiàn)報(bào)道如下。

1資料與方法

1．1一般資料

采集2016年12月至2017年3月9起感染性腹瀉疫情患者的肛拭子標(biāo)本101份。101份標(biāo)本均來(lái)自光明新區(qū)幼兒園和小學(xué)，主要臨床表現(xiàn)為嘔吐、腹痛、低熱、惡心等。

1．2儀器與試劑

天隆科技全自動(dòng)核酸提取儀（型號(hào)NP968－S），達(dá)安基因諾如病毒GⅠ／GⅡ／A組輪狀病毒三通道核酸檢測(cè)試劑盒，采用聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）－熒光探針法。

1．3方法

1．3．1標(biāo)本前處理將肛拭子加入含有3mL標(biāo)本稀釋液的采樣管中，混勻振蕩，靜置5min后進(jìn)行病毒核酸檢測(cè)。1．3．2病毒RNA提取吸取標(biāo)本處理液200μL，采用天隆科技全自動(dòng)核酸提取儀NP968－S提取病毒RNA，具體操作見說(shuō)明書。1．3．3熒光定量PCR檢測(cè)采用達(dá)安基因的諾如病毒GⅠ／GⅡ／A組輪狀病毒三通道核酸檢測(cè)試劑盒（PCR－熒光探針法）對(duì)疫情標(biāo)本進(jìn)行核酸快速檢測(cè)。1．3．4PCR擴(kuò)增陽(yáng)性標(biāo)本核酸采用2對(duì)擴(kuò)增引物進(jìn)行諾如病毒VP1基因PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增片段大小為1000bp，2對(duì)PCR引物分別為GⅡPF800M：5′－GAT－GCWGAYTAYTCYMGNTGGGA－3′（4289－4311）；GⅡCR1450：5′－ACCCARGMNTCAAAYCTRAART－3′（6622－6643）；GⅡPF750M：5′－CNGCHHTAGAR－RTNATGGT－3′（4341－4359）；GⅡ－R1M：5′－CCRCC－NGCATRNCCRTTRTACAT－3′（5367－5389）。首次PCR采用引物GⅡPF800M／GⅡCR1450進(jìn)行擴(kuò)增，反應(yīng)體系為25μL，PCR擴(kuò)增條件為：45℃30min反轉(zhuǎn)錄，94℃5min預(yù)變性，94℃1min，47℃1min，72℃3min，35個(gè)循環(huán)后72℃7min延伸。首次PCR擴(kuò)增產(chǎn)物采用引物GⅡPF750M／GⅡ－R1M進(jìn)行二次巢式PCR擴(kuò)增，反應(yīng)體系為25μL，PCR擴(kuò)增條件為：94℃5min預(yù)變性，94℃1min，47℃1min，72℃1．5min，29個(gè)循環(huán)后72℃7min延伸。2％瓊脂糖凝膠電泳鑒定目的條帶，大小為1000bp。1．3．5測(cè)序分析委托北京六合華大基因科技有限公司對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序，測(cè)得序列結(jié)果在BLAST上進(jìn)行對(duì)比尋找同源序列，并在GenBank上尋找參考株毒株。

1．4統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用MEGA7．0軟件中的Neighbor－joining方法（N－J法）構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，選擇Bootstrap程序進(jìn)行1000次重復(fù)取樣數(shù)目來(lái)分析進(jìn)化樹。

2結(jié)果

2．1流行病學(xué)調(diào)查及實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)結(jié)果

101份肛拭子標(biāo)本經(jīng)諾如病毒GⅠ／GⅡ／A組輪狀病毒三通道核酸檢測(cè)共獲得陽(yáng)性標(biāo)本54份，總陽(yáng)性率為53．47％，其中GⅡ型標(biāo)本52份，GⅠ型標(biāo)本1份，GⅠ和GⅡ型混合感染標(biāo)本1份。疫情暴發(fā)場(chǎng)所均為幼兒園和小學(xué)，高發(fā)人群為3～8歲幼年兒童，其次為青少年。暴發(fā)季節(jié)在冬春兩季。

2．2VP1基因核苷酸系統(tǒng)進(jìn)化分析

經(jīng)熒光定量PCR檢測(cè)出的54份陽(yáng)性標(biāo)本采用2對(duì)引物GⅡPF800M／GⅡCR1450和GⅡPF750M／GⅡ－R1M進(jìn)行諾如病毒VP1基因PCR擴(kuò)增，PCR產(chǎn)物經(jīng)序列測(cè)定共獲得48條基因序列，其余標(biāo)本因保存原因或信號(hào)弱，測(cè)序未成功。成功測(cè)序的48份NoV毒株VP1基因核酸序列經(jīng)比對(duì)分析見圖1。在47份GⅡ．P16／GⅡ．2亞型的NoV毒株中，有45份與2016年中國(guó)香港株（KY771081）和中國(guó)廣東株（KY485113）的核苷酸序列位于系統(tǒng)進(jìn)化樹上同一分支，同源性較高；2份GⅡ．P16／GⅡ．2亞型的NoV毒株（LB2017030310和LB2017030312）與2017年中國(guó)江蘇NoV重組株（KY806301）和2016年泰國(guó)清邁NoV重組株（MF972308）核苷酸序列表現(xiàn)出高度同源性（99％），而與2016年中國(guó)香港株（KY771081）和中國(guó)廣東株（KY485113）序列親緣性較遠(yuǎn)，并非同一進(jìn)化分支上。1份GⅡ．P7／GⅡ．6亞型的NoV毒株（LB201612120）與2014年中國(guó)臺(tái)灣株（KM267741）的核苷酸序列位于系統(tǒng)進(jìn)化樹上同一分支，同源性高達(dá)90％以上。與其他45份GⅡ．P16／GⅡ．2亞型NoV毒株不在同一進(jìn)化分支上的LB2017030310和LB2017030312NoV毒株卻與GⅡ．P7／GⅡ．6亞型的NoV毒株（LB2016121260）在同一進(jìn)化支上。

3討論

諾如病毒是引起嬰幼兒腹瀉的主要病因，同時(shí)也是引起成人腹瀉的第2病因，每年導(dǎo)致100萬(wàn)人住院及20萬(wàn)兒童（＜5歲）死亡。伴隨著輪狀病毒疫苗的研制成功和逐步推廣，諾如病毒有可能成為引起急性非細(xì)菌性胃腸炎和食源性疾病的首要病因。近年來(lái)，諾如病毒在世界范圍內(nèi)頻繁暴發(fā)，中國(guó)的感染率也不斷上升。本研究結(jié)果顯示，深圳市光明新區(qū)2016年12月至2017年3月暴發(fā)的9起諾如病毒疫情流行高峰在冬春季，與往年報(bào)道深圳地區(qū)諾如病毒感染的暴發(fā)季節(jié)一致［8］。101份諾如病毒感染性腹瀉病例以光明新區(qū)幼兒園和小學(xué)3～8歲幼年兒童為主，提示哨點(diǎn)監(jiān)測(cè)應(yīng)掌控在病毒主要的流行季節(jié)，并在相關(guān)場(chǎng)所做好相應(yīng)防護(hù)措施。諾如病毒具有豐富的遺傳多樣性，其基因組全長(zhǎng)7．5～7．8kb，包括3個(gè)開發(fā)閱讀框（OORFs）：ORF1、ORF2和ORF3。ORF2區(qū)編碼衣殼蛋白VP1，包括S區(qū)和P區(qū)，P區(qū)進(jìn)一步分為P1、P2區(qū)，其中P2區(qū)域含有結(jié)合受體的關(guān)鍵位點(diǎn)和病毒抗原性表位［9］。本研究選擇諾如病毒ORF1－ORF2區(qū)為靶基因，采用2對(duì)引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增并進(jìn)行分型測(cè)序。綜合9起暴發(fā)疫情測(cè)定病例標(biāo)本VP1全基因序列遺傳進(jìn)化分析表明，48份陽(yáng)性標(biāo)本中47份為GⅡ．P16／GⅡ．2亞型，其中45份與2016年中國(guó)香港株（KY771081）和中國(guó)廣東株（KY485113）核苷酸同源性最高，2份與2017年中國(guó)江蘇NoV重組毒株（KY806301）和2016年泰國(guó)清邁NoV重組毒株（MF972308）核苷酸同源性最高；1份為GⅡ．P7／GⅡ．6亞型，與2014年中國(guó)臺(tái)灣株（KM267741）核苷酸同源性最高。2份GⅡ．P16／GⅡ．2亞型的NoV毒株（LB2017030310和LB2017030312）與1份GⅡ．P7／GⅡ．6亞型的NoV毒株（LB201612120）在同一進(jìn)化分支上，提示這2株NoV毒株可能為重組株。基因重組是病毒進(jìn)化的重要手段，本研究發(fā)現(xiàn)，NoV毒株（LB2017030310和LB2017030312）可能是近年來(lái)新出現(xiàn)的GⅡ．P16／GⅡ．2亞型重組毒株，需要引起注意。同時(shí)，探索VP1區(qū)域變異與重組的相關(guān)性對(duì)于GⅡ．2亞型流行株重組機(jī)制的研究有重要意義。近20年研究表明，諾如病毒GⅡ型是引起感染的主要基因組，GⅡ．4亞型則是最流行的基因亞型［10］。本研究結(jié)果顯示，深圳市光明新區(qū)諾如病毒疫情暴發(fā)的主要型別為GⅡ型，優(yōu)勢(shì)流行株為GⅡ．P16／GⅡ．2亞型，并且出現(xiàn)2株可能為GⅡ．2亞型重組株。2016年深圳市諾如病毒主要流行株為GⅡ．2亞型，表明近2年流行株基因型由GⅡ．4亞型轉(zhuǎn)變?yōu)镚Ⅱ．2亞型；同時(shí)顯示在光明新區(qū)GⅡ．2亞型毒株比其他毒株有更高的侵襲力。從2016年冬季到2017年春季，9起諾如病毒疫情在光明新區(qū)呈地區(qū)聚集性暴發(fā)，而往年并沒有同類情況出現(xiàn)，引起這些聚集性暴發(fā)疫情的原因還有待進(jìn)一步調(diào)查研究。本研究初步對(duì)深圳市光明新區(qū)諾如病毒疫情暴發(fā)的病原體基因分型情況和分子流行病學(xué)特征進(jìn)行研究，為今后的預(yù)防控制積累了經(jīng)驗(yàn)。由于深圳地區(qū)人口流動(dòng)性大，而諾如病毒的基因型較多，每年都有不同的流行株，醫(yī)院、學(xué)校及食堂等公共場(chǎng)所成為諾如病毒大肆流行的主要聚集地［11－13］。因此，長(zhǎng)期對(duì)諾如病毒流行情況實(shí)施監(jiān)測(cè)很有必要。

參考文獻(xiàn)

［8］楊慧，李靜媚，陳應(yīng)堅(jiān)，等．2014年深圳市龍崗區(qū)諾如病毒胃腸炎暴發(fā)的分子流行病學(xué)特征［J］．熱帶醫(yī)學(xué)雜志，2016，16（9）：1208－1211．

［10］吳微，張宏斌，張海龍，等．2010年深圳地區(qū)諾如病毒的基因分型［J］．病毒學(xué)報(bào)，2012，28（3）：219－223．

［13］吳清平，薛亮，張菊梅．諾如病毒流行株GⅡ．4型進(jìn)化研究進(jìn)展［J］．微生物學(xué)報(bào)，2012，52（12）：1431－1438．

作者：鐘逶迤 姚云英 李燕 姚煒 羅淑華 劉滕穎子 汪東籬 單位：廣東省深圳市光明新區(qū)疾病預(yù)防控制中心