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【摘要目的摘要：通過體外分離和培養(yǎng)胎盤貼壁細胞，以探究其形態(tài)、表型和分化特征.方法摘要：采用IV型膠原酶消化人胎盤組織，獲得單個核細胞，接種于100mL/LFBS低糖DMEM培養(yǎng)基中，貼壁后常規(guī)換液、傳代，流式細胞儀檢測其表面標志，繪制生長曲線.采用β甘油磷酸鈉、維生素C、地塞米松聯(lián)合誘導，使胎盤貼壁細胞分化為成骨細胞，誘導后10d行茜素紅染色；采用地塞米松、胰島素誘導，使胎盤貼壁細胞分化為脂肪細胞，油紅O染色鑒定.結果摘要：培養(yǎng)7~14d后有少量貼壁細胞生長，逐漸呈成纖維細胞狀，表達CD29，CD44和CD105，不表達CD34，CD45，CD19；在成骨誘導10d后細胞茜素紅染色可見鈣鹽沉積，成脂肪誘導7d后油紅O染色見脂肪滴形成.結論摘要：通過不同方式誘導培養(yǎng)，胎盤貼壁細胞可分化為成骨細胞及脂肪細胞，提示胎盤貼壁細胞可能是新的干細胞來源.

【胎盤；貼壁細胞；干細胞

0引言

間充質干細胞（marrowstromalcell,MSC）主要來源于骨髓，可以分化為多種組織細胞摘要：成骨、軟骨、脂肪、神經(jīng)細胞等，但隨著年齡增長或合并感染、腫瘤等疾病時骨髓干細胞的分化能力明顯下降，因此尋找新的干細胞成為當務之急.近幾年來有學者發(fā)現(xiàn)胎盤組織中存在MSC.為進一步證實這一發(fā)現(xiàn)，我們從胎盤中提取貼壁細胞，觀察其生物學特性，以探索其是否具有干細胞特性.

1材料和方法

1.1材料足月剖宮產的胎盤（產婦同意），低糖DMEM（Gibco公司），新生牛血清（FBS，Gibco公司），IV型膠原酶（Sigma公司），胰蛋白酶（Sigma公司），鼠抗人單克隆抗體CD19，CD44，CD45，CD105，CD34，CD29（晶美公司），茜素紅（Sigma），油紅O（Sigma），倒置顯微鏡（Olympas），CO2培養(yǎng)箱（Jouan）.

1.2方法

1.2.1胎盤貼壁細胞的分離和培養(yǎng)取足月剖宮產胎盤，剪取胎兒側胎盤組織，PBS反復沖洗，剪成碎塊，以1g/LIV型膠原酶37℃消化30min，取上清液，以800r/min離心5min，沉淀物重復消化，收集每次離心后的細胞沉淀，PBS沖洗2遍，以1×107/L的密度接種于100mL/LFBSDMEM培養(yǎng)基中，貼壁后3~5d換液1次，取傳3代以上細胞備用.

1.2.2胎盤貼壁細胞的表型測定取第3代細胞，以2.5g/L胰蛋白酶消化3min，100mL/LFBS終止消化，PBS沖洗2遍，調整細胞數(shù)為1×104/μL，分別加入鼠抗人單克隆抗體CD19,CD44,CD45,CD105,CD34，流式細胞儀檢測細胞表型.

1.2.3生長曲線的繪制取第3代細胞，以2×107/L的密度接種于12孔板中，每日取3復孔，臺盼藍染色計數(shù)活細胞，連續(xù)培養(yǎng)計數(shù)7d，計算平均值，繪制生長曲線.

1.2.4細胞周期測定取第3代細胞，以2.5g/L胰蛋白酶消化3min，10mol/LFBS終止消化，PBS沖洗2遍，調整細胞數(shù)為1×106/L，流式細胞儀檢測細胞周期.

1.2.5細胞誘導分化及染色取第3代胎盤細胞，以2.5g/L胰蛋白酶消化3min,10mol/LFBS終止消化，800r/min離心5min，PBS沖洗3遍，分為4組分別以1×105/L細胞數(shù)接種于6孔板中，1組加入成骨誘導劑（20mmol/Lβ甘油磷酸鈉、50mg/L維生素C，10mmol/L地塞米松，100mL/L新生牛血清DMEM培養(yǎng)基），2組加入脂肪誘導劑（10mmol/L地塞米松、10mg/L胰島素、100mL/L新生牛血清DMEM培養(yǎng)基），3,4組為對照組，采用100mL/L新生牛血清DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)，置37℃，50mL/LCO2孵箱培養(yǎng)，每3~5日換液1次.取培養(yǎng)10d后的1，3組細胞，倒掉培養(yǎng)液，多聚甲醛固定30min，PBS沖洗3遍，茜素紅染色8h，顯微鏡下觀察陽性結果.取培養(yǎng)7d后的2，4組細胞，多聚甲醛固定后油紅O染色.

2結果

2.1胎盤細胞的原代培養(yǎng)消化胎盤組織獲得少量的單個核細胞，約7~14d后貼壁，從不規(guī)則形，逐漸變?yōu)樗笮危输鰷u狀生長，約4wk后長滿瓶底，胞體呈細長，形態(tài)類似成纖維細胞（圖2），1wk左右傳代1次，可穩(wěn)定傳至10代.流式細胞儀檢測顯示低表達CD29，高表達CD44和CD105，不表達CD34，CD45和CD19.細胞的對數(shù)生長期約在第2~4日，其倍增時間為39h（圖1）.流式細胞儀檢測發(fā)現(xiàn)G0/G1，S，G2/M期的比例分別為20.15%,72.54%和6.89%.

圖1胎盤貼壁細胞生長曲線（略）

2.2胎盤細胞的誘導分化成骨誘導組細胞在誘導10d時可見細胞呈漩渦狀重疊生長，并聚集成團，茜素紅染色可見多個散在分布大小、形態(tài)各異的不透明棕紅色鈣化結節(jié).對照組少見鈣化結節(jié)（圖3）.成脂肪誘導組細胞在誘導7d時油紅O染色可見細胞中出現(xiàn)多個染色深紅的脂肪滴，而對照組中則偶見脂肪滴（圖4）.

A摘要：培養(yǎng)10d；B摘要：培養(yǎng)28d.

圖2胎盤原代細胞×100（略）

A摘要：誘導組;B摘要：對照組.

圖3成骨細胞茜素紅染色×100（略）

A摘要：誘導組；B摘要：對照組.

圖4成脂細胞油紅O染色×100（略）

3討論

早在2000年即有學者從凍存的胎盤組織中分離培養(yǎng)出貼壁細胞［1］，但胎盤間充質干細胞（MSC）的探究尚處于起步階段.我們從形態(tài)學、免疫學及分化能力等方面加以探究進一步證實胎盤貼壁細胞的生物學特性.一般認為大多數(shù)MSC培養(yǎng)時貼壁，呈成纖維細胞狀，因而采用貼壁法獲得MSC的探究較多［2］.胎盤是實體組織，富含血管和間充質成分，我們采用酶消化法，獲取細胞沉淀進行培養(yǎng)，和骨髓貼壁細胞相比較，其貼壁時間較長（1~2wk），骨髓為72h［3］，并且胎盤貼壁細胞需28d左右才能鋪滿瓶底.骨髓貼壁細胞大多最初為梭形，7d左右形成小集落，其后迅速生長，變?yōu)榫坏拈L梭形［3］，和胎盤貼壁細胞相似.另外我們的實驗檢測到的胎盤貼壁細胞的倍增時間為39h，文獻中為37h［4］；我們檢測細胞周期顯示細胞大部分處于分裂期，而以往的報道發(fā)現(xiàn)細胞大部分處于靜息期［4］，因而胎盤貼壁細胞的特性尚需進一步研究.

目前對于胎盤貼壁細胞的免疫學特征尚無統(tǒng)一的熟悉，我們的探究發(fā)現(xiàn)胎盤貼壁細胞的表型和骨髓MSC相似［5-6］，表達CD29,CD44和CD105，不表達CD34,CD45,CD19,CD44,CD29均為黏附分子，是纖連蛋白和透明質酸鹽的受體，在基質細胞中表達較多，這樣的結果使我們推測培養(yǎng)的胎盤貼壁細胞中可能包含大量的能表達基質細胞標志的細胞，即MSC，但僅憑細胞形態(tài)和少量的表面標志尚不能完全說明貼壁細胞即為MSC，MSC的最重要特性應該是多向分化潛能.

假如胎盤貼壁細胞中含有MSC，理論上講MSC來源于中胚層，具有向中胚層組織及神經(jīng)外胚層組織分化的能力［7-8］.我們的實驗證實β甘油磷酸鈉和低濃度的地塞米松聯(lián)合誘導后細胞中鈣鹽沉積，茜素紅染色顯示產生大量鈣化結節(jié)，說明其有成骨能力，只有干細胞才具有這種能力.在誘導體系中維生素C可以促進體外培養(yǎng)細胞合成膠原，形成鈣化，能調節(jié)ATP及ALP活性，并影響其合成，β甘油磷酸鈉可以提供磷離子作為ALP的底物，地塞米松可以增強ALP活性.而ALP可以破壞鈣化抑制劑，啟動鈣化［8］形成鈣鹽，茜素紅特異性結合鈣劑，陽性表現(xiàn)為棕紅色，鈣的含量愈高染色愈深，是鑒定成骨細胞特性的特異性指標.

我們的實驗由于條件限制，只是初步觀察胎盤貼壁細胞的特征，證實其具有干細胞特性，但尚有許多新問題如培養(yǎng)的條件、促進生長的因子、傳代后是否逐漸衰老、誘導后移植的效果等等，需更深入的探究.我們的探究提示胎盤貼壁細胞的分離培養(yǎng)具有潛在的臨床應用價值.