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1材料與方法

1.1實驗用化學品和儀器耗材野生型線蟲N2和大腸桿菌OP50均由北京生命科學研究所惠贈。氯化鎘、氟化鈉、二水重鉻酸鈉、氯化錳、敵敵畏、二溴敵草快、五水硫酸銅、硫酸阿托品、苯、氯化鉀、氯化鈉、乳酸、硼酸、乙醇、乙二醇、無水-2-丙醇、甘油、甲醇、三氯乙酸、次氯酸鈉、檸檬酸等試劑購自美國Sigma-Aldrich公司。主要儀器:電子天平、漩渦震蕩儀、離心機、搖床、超凈工作臺、20℃恒溫培養箱、15℃恒溫培養箱和體視顯微鏡(MoticSMZ-140series)。

1.2線蟲的培養和試劑的配制常規方法培養線蟲，將線蟲同步化到L4期備用。趨避和趨向實驗用培養基(2.5g蛋白胨、17g瓊脂加超純水至1L，高壓滅菌)、疊氮化鈉(1mol/L)、五水硫酸銅(100mmol/L)、丁二酮(1%體積分數)、K-medium溶液(51mmol/L氯化鈉，32mmol/L氯化鉀)、線蟲染毒液(以K-medium溶液為溶劑，2.15倍比稀釋至所需濃度)。

1.3線蟲的染毒劑量用K-medium溶液洗下L4期的線蟲至50ml的離心管中，沉淀后立即用20ml的K-medium溶液洗3次。體視顯微鏡下調配線蟲的只數，使線蟲的密度在每20μl50只左右。向24孔板中加入等量的化學品和線蟲液，6h后觀察線蟲死亡情況，以線蟲無非正常死亡的最高濃度為趨避和趨向實驗的最高劑量濃度，并依次按2.15倍比稀釋，每化學品4個濃度梯度(表1)。

1.4趨避實驗參考Li等］及Stephen等的實驗方法，具體步驟如下:將9cm的含有培養基的培養皿等分為4個區域;在十字區域的一對側培養基上各涂布25μl的100mmol/L的五水硫酸銅溶液，靜置1～2h，等五水硫酸銅溶液滲入到培養基，在另一對側各滴加50只左右L4期的染毒線蟲(K-medium溶液處理過的線蟲作為陰性對照)。實驗6h后，分別計數兩對側培養基上的線蟲數(壓在十字線上的不計數)，分析線蟲是否進入含有Cu2+的區域;實驗組和對照組各4個平行樣，計算趨避指數=含Cu2+培養基上線蟲數目/培養基上線蟲總數。

1.5趨向實驗參考Li等、Bargmann等、Bargmann和HorvitzHR［8］的實驗方法，具體步驟如下:在含有培養基的培養皿中標記距離培養皿圓心均為2cm的兩點;在其中一個標記點上加1μl1%丁二酮(體積分數)和1μl1mol/L疊氮化鈉，另一標記點加1μl1mol/L疊氮化鈉，在距離上述兩點3cm處滴加100只左右L4期的染毒線蟲(K-medium溶液處理過的線蟲作為陰性對照);靜置6h后，計數距離兩標記點

1.5cm范圍內的線蟲數和線蟲總數;實驗組和對照組各4個平行樣，計算趨向指數=(丁二酮側線蟲數－疊氮化鈉側線蟲數)/培養基上線蟲總數。

1.6實驗數據處理組內兩兩比較:以不同濃度化學品的銅離子側線蟲平均數(趨避實驗)/丁二酮側－疊氮化鈉側線蟲平均數、線蟲總數平均數、對照組銅離子側線蟲平均數/丁二酮側－疊氮化鈉側線蟲平均數和對照組線蟲總數平均數，構建四格表資料，應用SPSS軟件中的卡方檢驗(Crosstabs)做統計分析，檢驗水準α=0.05。組間比較:以銅離子側線蟲平均數/丁二酮側－疊氮化鈉側線蟲平均數、線蟲總數平均數，應用SPSS軟件對化學品的5個濃度(包含對照組)做R乘C列的卡方檢驗，檢驗水準α=0.05。

2結果與分析

2.1趨避實驗結果與對照組比較，若任一劑量的雙側P值＜0.05，即判斷該化學品為趨避實驗陽性。趨避實驗為陽性的化學品共7個:二水重鉻酸鈉、氟化鈉、乙二醇、二溴敵草快、次氯酸鈉、乳酸和苯(表2)。

2.1.1化學品的趨避指數與GHS分級:隨著GHS級別的升高，不同毒性等級趨避實驗的陽性率有降低的趨勢(表3)。

2.1.2趨避實驗陽性劑量與GHS分級:隨著GHS級別的升高，不同毒性等級出現趨避實驗陽性的最高劑量值有增大的趨勢(表3)。

2.1.3趨避實驗最高劑量與24hLC50值:出現趨避實驗陽性的7個化學品中，GHSIII到V級，其24hLC50值約為本趨避實驗最高劑量的2～7倍;GHSVI級，其24hLC50值約為本趨避實驗最高劑量的10～12倍(表4)。

2.2趨向實驗結果與對照組相比較，若任一劑量的雙側P值＜0.05，即判斷該化學品為趨向實驗陽性。趨向實驗為陽性的化學品共15個:二水重鉻酸鈉、氟化鈉、三氯乙酸、甲醇、乙二醇、硫酸阿托品、甘油、次氯酸鈉、乳酸、檸檬酸、氯化錳、氯化鈉、氯化鎘、硼酸、苯(表2)。

2.2.1化學品的趨向指數與GHS分級:隨著GHS級別的升高，不同毒性等級趨向實驗陽性率有升高的趨勢(表3)。

2.2.2趨向實驗陽性劑量與GHS分級:隨著GHS級別的升高，不同毒性等級出現趨向實驗陽性的最高劑量值有增大的趨勢(表3)。

2.2.3趨向實驗最高劑量與24hLC50值:出現趨向實驗陽性的15個化學品中，GHSⅢ到Ⅵ級，多數化學品的線蟲24hLC50值約為本趨向實驗最高劑量的2～12倍(表5)。

3討論

作為具有諸多優勢的體內模式生物，線蟲在毒理學研究中的應用越來越廣泛，如應用線蟲研究重金屬［9］及農藥的生態毒理學效應及其機理。在化學品的毒性篩檢方面，線蟲的應用也有了一定的研究成果［1，3-4］，另外，王曉祎等利用線蟲對農藥廢水開展了相關分離組分的毒性評價研究，顯示了線蟲在化學品毒性評價中的重要作用。線蟲的趨避實驗及趨向實驗是研究線蟲感知行為的經典方法。2000年，Stephen等［6］通過線蟲對Cu2+的趨避作用，探討了突變體以及動力蛋白重鏈的缺失對線蟲趨避行為的影響。Saeki等［12］通過趨向性實驗，將線蟲暴露于高劑量重金屬離子，證明了重金屬離子對線蟲的感知行為有破壞作用。在本實驗室前期對21種化學品進行了急性毒性研究的基礎上，本研究采用GHS不同毒性等級的21個化學品的不同濃度對線蟲進行6h亞急性染毒，通過趨避實驗和趨向實驗，觀察化學品對線蟲感知行為的影響，初步探討趨避指數與趨向指數這2個非致死性亞急性指標與化學品毒性分級的聯系，以及該兩項指標與線蟲急性毒性指標(24hLC50)的內在聯系及劑量關系，并據此推薦適于今后線蟲亞急性毒性研究的初始檢測指標及可供參考的劑量范圍。由于GHS6個毒性等級中的Ⅰ和Ⅱ級的化學品屬于特殊管制類化學品，本研究只選取了Ⅲ到Ⅵ毒性等級的化學品。

3.1化學品的線蟲趨避指數與其GHS分級、24hLC50有一定關聯趨避實驗結果顯示:與對照組相比，21個化學品中有7個出現趨避實驗陽性;隨著GHS分級升高(化學品毒性降低)，趨避實驗的陽性率有降低的趨勢，趨避實驗陽性的最高劑量值有隨GHS級別升高而升高的趨勢;GHSⅢ到Ⅴ級，線蟲24hLC50值約為本趨避實驗最高劑量的2～7倍，GHSⅥ級，24hLC50值約為趨避實驗最高劑量的10～12倍。未染毒的對照組線蟲對五水硫酸銅有一定的趨避能力，由于染毒化學品對線蟲感知行為的影響擾亂了線蟲的趨避能力，使線蟲進入了含有銅離子的區域。本實驗21個化學品中的7個有趨避能力，可以推斷趨避指數可以在一定程度上反映化學品對線蟲的感知行為的毒害作用。GHS毒性等級的分類是根據大小鼠的毒性實驗得出的，隨著GHS分級的升高，趨避實驗陽性率有下降趨勢，而出現趨避陽性的最高劑量則有升高的趨勢，說明利用線蟲的趨避指數對化學品開展感知行為的毒性評價與利用大小鼠開展毒性評價有一定的相關性。

3.2化學品的線蟲趨向指數與其GHS分級、24hLC50有一定關聯趨向實驗結果顯示:與對照組相比，21個化學品中有15個出現趨向實驗陽性;隨著GHS分級升高，趨向實驗的陽性率有升高的趨勢，且趨向實驗陽性的最高劑量值也有隨GHS級別升高而升高的趨勢;GHSⅢ到Ⅵ級，線蟲24hLC50值約為本趨向實驗最高劑量的2～12倍。未染毒的對照組線蟲有一定的趨向能力，染毒后的線蟲由于化學品的不同或濃度的不同會對線蟲的趨向能力產生一定的影響，這種影響可能是增大線蟲的趨向能力，也可能是減弱這種能力。本研究中線蟲趨向陽性的概率較高，說明利用線蟲的趨向指數評價化學品對線蟲感知行為的毒性影響有一定的價值。隨著GHS分級的升高，趨向實驗陽性率和出現趨向陽性的最高劑量均有升高的趨勢，說明利用線蟲的趨向指數對化學品開展感知行為的毒性評價與利用大小鼠開展毒性評價有一定的相關性。3.3化學品的線蟲亞急性毒性檢測推薦指標及推薦染毒劑量范圍綜上所述，本研究中的趨避指數和趨向指數與化學品毒性大小相關聯，可以將這2個指數作為研究化學品的線蟲亞急性毒性初始檢測的推薦指標。線蟲6h染毒的趨避實驗的推薦染毒劑量:GHSⅢ到Ⅴ級，最高劑量為線蟲24hLC50值的1/7～1/2，GHSⅥ級，最高劑量為線蟲24hLC50值的1/12～1/10;線蟲6h染毒的趨向實驗的推薦染毒劑量:GHSⅢ到Ⅵ級，最高劑量為線蟲24hLC50值的1/12～1/2。基于本實驗結果，推薦今后線蟲的亞急性毒性實驗的最高染毒劑量為其24hLC50的1/12～1/2。

4結論

21個化學品中，二水重鉻酸鈉、氟化鈉、乙二醇、硫酸阿托品、次氯酸鈉、乳酸和苯7個化學品同時出現趨避和趨向實驗陽性，且這7個化學品分布在GHSⅢ到Ⅵ級的4個毒性等級中，可以進一步說明線蟲的趨避指數和趨向指數與化學品毒性大小有一定的關聯性，可以將這2個指標作為研究化學品的線蟲亞急性毒性檢測的初始檢測指標。但是，每一毒性等級并不是所有化學品均對上述兩項指標敏感，說明在化學品亞急性染毒條件下，趨避指數和趨向指數作為線蟲的亞急性毒性評價指標有一定的局限性，故推薦其用于評價那些對線蟲感知行為有影響的化學品的亞急性非致死性毒性效應。同時，本研究的染毒劑量范圍和評價模式為今后化學品的線蟲亞急性毒性其他指標的評價研究提供了實驗研究基礎，具有一定的參考價值。

作者：曾迎新孔慶征李煜敬海明馬玲寧鈞宇譚壯生高珊李國君單位：首都醫科大學公共衛生學院北京市疾病預防控制中心/北京市預防醫學研究中心食物中毒診斷溯源技術北京市重點實驗室