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【摘要】目的探討慢性阻塞性肺疾病(COPD)模型小鼠骨骼肌萎縮可能存在的分子機制。方法按隨機數字表法將6～8周齡雄性C57BL/6J小鼠隨機分為正常對照組和COPD模型組，每組各10只，均在標準環境下飼養。COPD模型組用香煙煙熏12周，正常組不予特殊干預，通過肺臟病理驗證COPD小鼠造模是否成功。免疫組化分析兩組小鼠骨骼肌中自噬相關蛋白Beclin1及P62的表達和肌肉萎縮相關分子標記物FBXO32及TRIM63的表達;免疫熒光分析炎癥標志物NF－κBP65入核表達情況。結果煙熏12周造模成功，肺臟病理結果提示COPD模型組平均肺泡間隔里襯(83．00±12．71)明顯高于正常對照組(30．60±4．39)，差異有統計學意義(P＜0．001)。免疫組化分析顯示，在COPD模型組小鼠骨骼肌中，自噬相關分子Beclin1較正常對照組升高，P62較正常對照組下降，肌肉萎縮相關分子標記物FBXO32及TRIM63均明顯高于正常對照組，差異均有統計學意義(P＜0．001)。免疫熒光分析顯示，在COPD模型小鼠骨骼肌中，NF－κBP65入核表達(18．00±2．55)明顯高于正常對照組(7．60±1．52)，差異有統計學意義(P＜0．001)。結論COPD小鼠骨骼肌萎縮潛在的分子機制可能與香煙煙霧激活的自噬調控炎癥因子表達有關。

【關鍵詞】小鼠；慢性阻塞性肺疾病；骨骼肌；萎縮

慢性阻塞性肺疾病(chronicobstructivepulmonarydisease，COPD)是一種以氣流受限且不完全可逆為特征的常見呼吸系統疾病，嚴重影響患者身心健康，死因位列全球第3位，致殘率位列全球第5位［1］。目前研究發現，COPD不僅為表現在肺部的單一疾病，而且還累及全身多個系統，產生廣泛的肺外損傷效應，包括心血管系統疾病、自主神經功能紊亂及骨骼肌萎縮等［1，2］。其中骨骼肌萎縮可嚴重影響患者的勞動力水平、生活質量甚至是預后，有研究認為其與COPD病死率密切相關，是預測COPD患者死亡的獨立危險因素之一［3］。故本研究立足于COPD小鼠動物模型來探討COPD骨骼肌萎縮可能存在的分子機制。

1材料與方法

1．1實驗動物

選取健康雄性6～8周齡SPF級C57BL/6J小鼠20只，體重18～22g，購自北京華阜康生物科技股份有限公司，實驗動物生產許可證號:SCXK(京)2014－0004，動物批次合格證號:11401300070688。所有動物均在標準環境下飼養，室溫20～26℃，相對濕度40%～70%。

1．2儀器和試劑

儀器:脫水機(型號:JJ－12J)、凍臺(型號:JB－L5)和包埋機(型號:JB－P5)購自武漢俊杰電子有限公司，病理切片機(型號:RM2016)購自上海徠卡儀器有限公司，組織攤片機(型號:KD－P)購自浙江省金華市科迪儀器設備有限公司，烤箱(型號:DHG－9140A)購自上海慧泰儀器制造有限公司，微波爐(型號:P70D20TL－P4)購自格蘭仕微波爐電器有限公司，搖床(型號:TSY－B)購自武漢谷歌生物科技有限公司，顯微鏡(型號:DMi1)購自德國徠卡公司。試劑:一抗:Beclin1(貨號:ab207612)和P62(貨號:ab56416)購自Abcam公司(美國)，FBXO32(貨號:12866－1－AP)和TRIM63(貨號:55456－1－AP)購自ProteintechGroup公司(美國)，NF－κBP65(貨號:8242)購自CellSigna-lingTechnology公司(美國);二抗:辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔、山羊抗鼠以及熒光標記的山羊抗兔均購自KPL公司(美國)，組化試劑盒DAB顯色劑購自武漢谷歌生物科技有限公司。

1．3建立COPD動物模型

按照隨機數字表法將小鼠隨機分為正常組和干預組，每組各10只。正常組不予特殊處理，干預組置于一約50L的密閉容器中，每天全身暴露于10支大前門牌香煙(每支香煙含11mg煤焦油，0．8mg尼古丁)所產生的煙霧中，保持容器中含氧量為18%左右，每次暴露約60min，持續12周，具體方法參見文獻［4］。

1．4病理檢測

煙熏12周后取小鼠肺組織行蘇木精－伊紅染色，觀察COPD是否造模成功。對兩組小鼠趾長伸肌進行取材，4%甲醛固定，對固定后的組織進行脫水、包埋、切片，依次將組織切片放入二甲苯及乙醇中進行脫蠟處理，而后置入抗原修復緩沖液中于微波爐內進行抗原修復，3%牛血清蛋白均勻覆蓋組織，室溫封閉30min，加入相應的一抗，4℃孵育過夜。滴加與一抗相應種屬的二抗覆蓋組織，室溫孵育50min，DAB顯色，蘇木素或DAPI染核，脫水封片，普通顯微鏡或熒光顯微鏡下觀察，免疫熒光需避光處理。

1．5計算平均肺泡間隔里襯(meanlinearintercept，MLI)

低倍鏡200倍，每個切片隨機觀察10個視野，每個視野中心劃“十”字交叉線，測量“十”字線總長度(L)，計算與交叉線相交的肺泡間隔數(NS)，MLI=L/NS［4］，可反映肺泡平均直徑大小。

1．6免疫組化及免疫熒光數據收集

隨機選取10個不同的視野，采用圖像處理軟件IPP6．0進行分析，免疫組化采用光密度值(opticaldensity，OD)表示，免疫熒光采用計算單位視野下merge后核紅染的細胞個數。1．7觀察指標①觀察肺組織病理改變;②比較兩組小鼠MLI;③免疫組化法分析兩組小鼠骨骼肌中自噬相關蛋白Beclin1及P62的表達和肌肉萎縮相關分子標記物FBXO32及TRIM63的表達;④免疫熒光分析炎癥標志物NF－κBP65入核表達情況。1．8統計學方法采用SPSS20．0軟件對數據進行統計學分析。計量資料以均數±標準差(x珋±s)表示，組間比較采用t檢驗。P＜0．05認為差異具有統計學意義。

2結果

2．1正常對照組和COPD模型組肺組織病理改變比較與正常對照組相比，COPD模型組小鼠肺泡腔直徑明顯增大，肺泡壁破壞增加，肺泡間隔斷裂增多(見圖1)，提示COPD小鼠模型成功建立。

2．2兩組小鼠MLI比較經統計，COPD模型組小鼠MLI(83．00±12．71)μm明顯高于正常對照組小鼠(30．60±4．39)μm，差異具有統計學意義(t=－8．71，P＜0．001)。2．3兩組小鼠免疫組化比較與正常對照組相比，自噬相關蛋白Beclin1在COPD模型組小鼠骨骼肌中表達增加，P62在COPD小鼠骨骼肌中表達減少，骨骼肌萎縮相關蛋白TRIM63和FBXO32在COPD小鼠骨骼肌中表達增加，由此可知COPD模型組小鼠骨骼肌中自噬水平較正常組升高，骨骼肌萎縮相關蛋白的表達同樣較正常組升高。

2．4兩組小鼠骨骼肌細胞NF－κBP65入核比較經統計，COPD模型組NF－κBP65入核陽性細胞數(18．00±2．55)(個/單位視野)明顯高于正常對照組(7．60±1．52)(個/單位視野)，差異有統計學意義(t=－7．84，P＜0．001)，由此可知COPD模型組小鼠骨骼肌中炎癥水平較正常對照組升高。

3討論

目前研究已經證實COPD為累及全身多系統的慢性炎癥疾病，與吸煙密切相關，骨骼肌萎縮為COPD重要的肺外表現之一。骨骼肌萎縮引起的勞動力下降會給COPD患者及其家庭、社會帶來沉重的經濟負擔［5］。本研究發現，COPD模型小鼠的骨骼肌自噬水平均較正常組升高，NF－κBP65入核表達較正常組升高，同時肌肉萎縮相關分子標記物TRIM63和FBXO32的表達較正常組升高。表明COPD骨骼肌萎縮機制可能與由香煙煙霧激活自噬調控炎癥因子表達有關。平均肺泡間隔里襯(MLI)可間接反映肺泡直徑的大小，常用來評估COPD模型動物是否造模成功［4］。自噬是指吞噬細胞自身受損、變性的蛋白或細胞器包被入囊泡，與溶酶體融合形成自噬溶酶體并對其進行消化降解的過程［6］。自噬在機體的生理和病理過程中均可發生，有研究表明自噬是把雙刃劍，在細胞生理狀態下自噬負責降解受損的蛋白或是細胞器以完成細胞的代謝及細胞器的更新。但是在某些病理條件下，過度激活的自噬或是自噬受損會加劇機體的炎癥反應及細胞凋亡［7］。Beclin1與P62是常見的自噬相關蛋白，常用來評價自噬水平的高低。Beclin1是參與自噬過程的重要信號分子，可介導多種自噬蛋白定位于自噬體，與多種信號分子發生反應調控自噬的形成與成熟，故Beclin1在自噬激活時表達升高，可作為自噬水平高低的標記物。P62是一種細胞內的多功能蛋白，參與調控多種信號通路，P62可將受損的蛋白或是細胞器等“貨物”轉運至自噬溶酶體，然后與這些“貨物”一起降解，故P62的表達在自噬激活時下降，也常作為自噬水平的標記物［8］。TRIM63與FBXO32是泛素蛋白酶體系統中調節蛋白質降解的關鍵酶，可作為骨骼肌萎縮的分子標記物［3］。Vij等［9］研究表明，香煙煙霧可誘導自噬從而加重COPD的肺衰老。Ryter等［10］研究發現，香煙煙霧誘導的自噬激活可引起氣道上皮細胞的凋亡。抑制自噬可抑制香煙煙霧或是細微顆粒誘導的氣道上皮細胞的炎癥反應及黏液高分泌［11，12］。我們此前研究表明14，15－環氧二十碳三烯酸可通過抑制自噬減輕香煙煙霧誘導的支氣管上皮細胞的炎癥反應［13］。本研究提示，在香煙煙霧誘導的COPD模型小鼠MLI高于正常對照組，骨骼肌中自噬相關分子Beclin1表達升高及P62的表達下降，TRIM63和FBXO32的表達升高，NF－κBP65入核表達較正常對照組高，說明在COPD小鼠的骨骼肌中自噬及炎癥水平與氣道中一致，在香煙煙霧刺激下均升高。NF－κB廣泛存在于真核細胞中，是重要的轉錄調節因子，可參與細胞的炎癥、凋亡及增殖等多種生理及病理過程。研究表明，激活NF－κB可導致骨骼肌萎縮［14］。COPD患者膈肌中泛素蛋白酶體系統被激活，可加速膈肌蛋白的降解，導致肌肉萎縮［15］。Haegens等［16］發現，NF－κB的激活可誘導FBXO32及TRIM63的表達，從而啟動泛素蛋白酶體系統，加快骨骼肌蛋白的降解。由此可知，抑制自噬和NF－κB轉錄活性可降低由于香煙煙霧刺激引起的COPD的骨骼肌萎縮。

4結論

COPD骨骼肌萎縮機制復雜，本研究提示可能與香煙煙霧激活自噬引起的骨骼肌細胞NF－κBP65入核表達增加有關。但本研究僅限于動物模型，具體的分子機制及相關通路需我們更為深入的研究。

作者：吳艷軍；李云霄；王浩彥；譚春婷；徐波；于剛剛單位：首都醫科大學附屬北京友誼醫院呼吸內科