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《臨床醫(yī)學(xué)工程雜志》2014年第八期

1方法

1．1動(dòng)物分組、造模方法及給藥方法取4批NIH雄性小鼠，每批按體重隨機(jī)分為6組，每組10只，分別為正常對(duì)照組、模型對(duì)照組、匹多莫德分散片組（0．267g•kg－1）、參芍葡萄籽提取物方劑高（1g藥材＋80mgGSE•kg－1）、中（0．5g藥材40mgGSE•kg－1）、低（0．25g藥材＋20mgGSE•kg－1）劑量組。正常對(duì)照組腹腔注射10mL•kg－1生理鹽水，除正常對(duì)照組外，其余免疫抑制小鼠腹腔注射環(huán)磷酰胺100mg•kg－1，每周1次，連續(xù)4周。各給藥組按劑量灌胃給予相應(yīng)藥物20mL•kg－1，每天1次，連續(xù)30天。

1．2對(duì)免疫抑制小鼠免疫器官重量的影響末次給藥后1h脫頸椎處死小鼠，取胸腺、脾臟稱(chēng)重，計(jì)算胸腺指數(shù)、脾臟指數(shù)［1］。

1．3對(duì)2,4－二硝基氯苯誘導(dǎo)免疫抑制小鼠遲發(fā)型超敏反應(yīng)的影響給藥第3周，各組小鼠均背部脫毛，7％DNCB丙酮溶液50μL于脫毛處均勻涂抹致敏。末次給藥后1h，用1％DNCB丙酮溶液20μL涂抹于小鼠右耳兩面進(jìn)行攻擊，24h后脫頸椎處死小鼠，用8mm金屬打孔器打下小鼠左、右耳片，稱(chēng)重，以右耳減去左耳重量差值作為遲發(fā)型超敏反應(yīng)值［2］。

1．4對(duì)免疫抑制小鼠半數(shù)溶血值HC50的影響具體如下［3］：給藥第24天，除正常對(duì)照組外每只小鼠腹腔注射0．2mL2％（v／v）SRBC進(jìn)行免疫。6天后，摘除眼球取血，2000rpm離心10min，取血清用SA緩沖液稀釋?zhuān)?00倍），取稀釋后的血清1mL置試管內(nèi)，對(duì)照管取1mLSA緩沖液，依次加入10％（v／v）SRBC0．5mL，1∶8SA稀釋的豚鼠血清1mL。置37℃水浴中孵育20min后，冰浴終止反應(yīng)。2000rpm離心10min。取上清液1mL，加都氏試劑3mL，同時(shí)取10％（v／v）SRBC0．25mL加都氏試劑至4mL于另一支試管內(nèi)，充分混勻，放置10min后，于540nm波長(zhǎng)測(cè)定各管吸光度值。

1．5對(duì)免疫抑制小鼠碳粒廓清能力的影響具體如下［1］：末次給藥后1h，小鼠尾靜脈注射墨汁10mL•kg-1（墨汁∶生理鹽水為1∶4）。注入墨汁后2min、15min，小鼠眼眶后靜脈叢取血20μL，加到2mL0．1％Na2CO3溶液中。675nm波長(zhǎng)處測(cè)吸光度值，以Na2CO3溶液作空白對(duì)照。同時(shí)將小鼠處死取脾臟和肝臟，按下式計(jì)算吞噬指數(shù)K和吞噬系數(shù)α。

1．6統(tǒng)計(jì)方法結(jié)果以均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用單因素方差分析，組間均數(shù)兩兩比較用S－N－K法，由SPSS15．0完成。

2實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2．1對(duì)免疫抑制小鼠免疫器官重量的影響表1表明，與正常對(duì)照組比較，模型對(duì)照組小鼠胸腺指數(shù)、脾臟指數(shù)均顯著降低（P＜0．01）。與模型對(duì)照組相比，參芍葡萄籽提取物方劑高、中、低劑量組小鼠胸腺指數(shù)、脾臟指數(shù)均明顯增大（P＜0．01）。

2．2對(duì)2,4－二硝基氯苯誘導(dǎo)免疫抑制小鼠遲發(fā)型超敏反應(yīng)的影響表1表明，與正常對(duì)照組比較，模型對(duì)照組小鼠遲發(fā)型超敏反應(yīng)值顯著減小（P＜0．01）。與模型對(duì)照組相比，參芍葡萄籽提取物方劑高、中、低劑量組小鼠遲發(fā)型超敏反應(yīng)值明顯增大（P＜0．01）。

2．3對(duì)免疫抑制小鼠半數(shù)溶血值HC50的影響表2表明，與正常對(duì)照組比較，模型對(duì)照組小鼠半數(shù)溶血值HC50顯著減小（P＜0．01）；與模型對(duì)照組相比，參芍葡萄籽提取物方劑高、中、低劑量組小鼠半數(shù)溶血值HC50明顯增大（P＜0．01）。

2．4對(duì)免疫抑制小鼠碳粒廓清能力的影響表2表明，與正常對(duì)照組比較，模型對(duì)照組小鼠K值、α值均顯著減小（P＜0．01）；與模型對(duì)照組相比，參芍葡萄籽提取物方劑高、中、低劑量組小鼠K值、α值均明顯增大（P＜0．01）。

3討論

免疫系統(tǒng)是機(jī)體必需的防御系統(tǒng)，脾臟和胸腺是主要的免疫臟器，是淋巴細(xì)胞分化、居留、增殖和產(chǎn)生免疫應(yīng)答的場(chǎng)所。脾臟指數(shù)和胸腺指數(shù)在一定程度上可反映機(jī)體非特異性免疫功能。環(huán)磷酰胺作為一種免疫抑制劑，能抑制動(dòng)物的體液和細(xì)胞免疫應(yīng)答，造成免疫抑制。本試驗(yàn)腹腔注射CTX4次后，模型對(duì)照組小鼠的胸腺指數(shù)和脾臟指數(shù)顯著低于正常對(duì)照組，說(shuō)明免疫抑制小鼠模型復(fù)制成功。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，各劑量組的參芍葡萄籽提取物方劑均可增加免疫抑制小鼠的胸腺指數(shù)和脾臟指數(shù)，具有免疫增強(qiáng)活性，且呈一定的劑量相關(guān)性。遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng)是細(xì)胞免疫反應(yīng)，當(dāng)致敏T淋巴細(xì)胞再次接觸相同的抗原時(shí)，能引起遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng)，T淋巴細(xì)胞釋放出多種細(xì)胞因子，產(chǎn)生以單核細(xì)胞浸潤(rùn)為主的炎癥，表現(xiàn)為皮膚紅腫、硬結(jié)等。參芍葡萄籽提取物方劑各劑量組能使小鼠耳腫脹反應(yīng)值水平較模型對(duì)照組顯著升高，表明參芍葡萄籽提取物方劑可增強(qiáng)小鼠細(xì)胞免疫功能。血清溶血素水平可反映體液抗體形成水平［5］，反映機(jī)體的體液免疫作用的狀態(tài)。用SRBC免疫小鼠后，產(chǎn)生抗SRBC抗體（溶血素IgM），在補(bǔ)體參與下導(dǎo)致紅細(xì)胞溶解，釋放出血紅蛋白使溶液顏色產(chǎn)生變化，反映紅細(xì)胞的溶血量。紅細(xì)胞溶血與免疫后血清中產(chǎn)生的抗體含量有關(guān)，測(cè)定HC50可評(píng)價(jià)血清中抗體數(shù)量，進(jìn)而反映小鼠體液免疫功能。吞噬細(xì)胞的吞噬能力是衡量機(jī)體非特異性免疫功能的指標(biāo)之一，非特異性免疫是機(jī)體免疫系統(tǒng)的重要組成部分，當(dāng)細(xì)菌、異物等抗原性物質(zhì)進(jìn)入機(jī)體后，可迅速被單核巨噬系統(tǒng)吞噬和清除，碳粒廓清法測(cè)定單核巨噬細(xì)胞功能是經(jīng)典的觀察單核巨噬細(xì)胞吞噬能力的方法［8-9］，可反映小鼠非特異性免疫的狀態(tài)。

在本實(shí)驗(yàn)中，參芍葡萄籽提取物方劑能通過(guò)非特異性免疫調(diào)節(jié)作用，明顯增加免疫抑制小鼠胸腺指數(shù)和脾臟指數(shù)；提高免疫抑制小鼠遲發(fā)型超敏反應(yīng)值和HC50值，具有提高細(xì)胞免疫及體液免疫的作用；提高吞噬細(xì)胞的吞噬能力，具有增強(qiáng)機(jī)體非特異性免疫的功能；提示參芍葡萄籽提取物方劑對(duì)CTX所致免疫抑制小鼠具有增強(qiáng)免疫功能的作用［10］。以釀酒過(guò)程中產(chǎn)生的葡萄籽為原料，提取富含多酚類(lèi)物質(zhì)的葡萄籽提取物，不僅能為葡萄的綜合利用開(kāi)辟新途徑，而且還可帶來(lái)巨大的經(jīng)濟(jì)效益和社會(huì)效益。歷經(jīng)幾十年的研究與開(kāi)發(fā)，葡萄籽提取物（GSE）優(yōu)越的抗氧化活性已為人們認(rèn)可，并在食品、藥品及化妝品等領(lǐng)域得到了廣泛應(yīng)用。基于國(guó)內(nèi)外研究基礎(chǔ)，結(jié)合使用中藥及GSE，有望開(kāi)發(fā)成為具增強(qiáng)免疫功能的保健品。

作者：梁政嬈梁菊單位：廣東省肇慶市中醫(yī)院