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《生物工程學報雜志》2014年第六期

1材料與方法

1.1材料與試劑蛋清溶菌酶(HeneggwhiteLysozyme)購自Sigma公司；陽離子交換凝膠介質(SPSepharoseFF)購自GEHealthcare公司；其他所用試劑均為分析純。

1.2核磁共振波譜儀及參數600M核磁共振波譜儀(BrukerAscend-600AvanceIII)，TCI三共振反式超低溫探頭。一維核磁共振氫譜(1H-NMR)采用的脈沖程序為noesygppr1d，采樣16次；二維氫氫全相關譜(2D-1H-1HTOCSY)采用的脈沖程序為dipsi2gpph19，采樣24次；采樣前進行90°脈沖校準以及水峰的壓制。

1.3吸附蛋白的氫氘交換標記蛋白在陽離子交換介質上的吸附以及標記路線如圖1。首先，陽離子交換介質SPSepharoseFF裝填成柱體積為1mL的色譜柱，用起始緩沖液(20mmol/LPBS,pH7.0)平衡色譜柱；然后，蛋白質溶解到起始緩沖液配成0.21mmol/L溶液，進樣5ml，緩沖液淋洗并且檢測紫外吸收值，當紫外吸收值為零時，停止淋洗。其次，用標記緩沖液(D2O，20mmol/LPBS，pD7.0)流經色譜柱，15min后通入淬滅緩沖液(D2O，20mmol/LNaAC，pD3.0)終止氫氘交換反應。最后，已經標記完之后的蛋白用洗脫液(D2O，20mmol/LNaAC，1mol/LNaCl,pD3.0)洗脫，所獲的標記蛋白用3kDa的超濾膜脫鹽凍干之后核磁共振檢測。對照組樣品(沒有吸附的蛋白)的做法和上述步驟相似，除去不添加吸附陽離子交換介質以及洗脫液。

1.4氫氘交換數據分析溶菌酶氨基酸殘基核磁共振信號根據與α位碳相連的酰胺氫(NH-CαH)來歸屬，并以文獻報道結合生物大分子核磁共振數據庫BiologicalMagneticResonanceBank(BMRB4562)為參考。峰強度(I)通過軟件Topspinversion3.0標定。為了排除樣品濃度的影響，以不發生氫氘交換的芳香族氨基酸Trp108的H4-H5相關峰為參考峰，對特征殘基峰的強度進行歸一化處理，如式(1)：式中Ipeak為殘基峰的強度；Ireference為參考峰的強度；Inomalize為歸一化后的峰強度。通過比較不同狀態歸一化后蛋白殘基峰強度的變化可以獲取蛋白各個殘基酰胺氫對溶劑可及的敏感程度以及酰胺氫被保護程度等信息[16-17]。1.5溶劑可及表面計算通過分子模擬軟件Accelrysdiscoverystudio(Accelrys,Inc.SanDiego,USA)計算蛋白各個殘基的溶劑可及表面百分比(Solventaccessiblesurfacearea，SASA)。溶菌酶的三維結構來源于蛋白質結構數據庫(PDBcode:1E8L)，探針半徑為1.4Å。1.6蛋白靜電勢計算蛋白質靜電勢采用通用算法程序，利用分子模擬Accelrysdiscoverystudio軟件中Delphi模塊進行蛋白靜電勢的模擬計算。

2結果與分析

2.1溶菌酶的氫氘交換特征蛋白質氫氘交換技術是探測溶液中蛋白質的結構穩定性、折疊動力學和相互作用的重要研究工具，但在蛋白質液固界面吸附中應用較少。為確定溶菌酶在液固界面研究中的交換條件和可行性，首先考察了溶菌酶的氫氘交換特征，通過測定溶菌酶在不同狀態下1D1H-NMR譜及其酰胺氫峰強度隨時間變化，來評估蛋白結構對氫氘交換的敏感性以及交換反應的合理時間。結果如圖2所示，測定了溶菌酶在天然態(90%H2O/10%D2O，pH7.0，25℃)和變性態(60%ACN/40%D2O，pH7.0，25℃)不同時間間隔點的一維核磁共振氫譜(1D1H-NMR)。其中，由于1D氫譜中大部分殘基的譜峰疊加，單獨選取了譜峰清晰分辨率較高的W123、W111、W63和W108四個代表殘基來觀察溶菌酶在天然態和變性態的動力學變化。天然態(圖2，A-1、A-2)顯示，4個殘基的酰胺氫峰強度在開始10min內快速下降，在20min到180min時則下降趨緩。對比變性態(圖2B-1、B-2)，溶菌酶酰胺氫不但化學位移有顯著變化，并且4個殘基的峰強在更短時間約5min內降到最低。這反映出天然態溶菌酶能夠保持緊密三維球形狀態，氘離子較難到達處于蛋白內部的殘基區域，氫氘交換速率及峰強下降比較緩慢；而在變性劑乙腈溶液中，蛋白結構發生改變，致使個別殘基峰周圍的電子云環境改變而造成化學位移改變，并且由于蛋白去折疊，溶劑中的氘離子很容易到達去折疊的酰胺區域發生氘代反應，峰強下降且很快達到平衡。以上現象表明溶菌酶的結構變化對氫氘交換反應非常敏感，蛋白的去折疊程度可由其評估。此外氫氘交換在天然態和變性態下達到平衡的時間分別是10min和5min，因此在后續實驗中蛋白在陽離子交換介質上吸附交換時間控制在10min以上。

2.2溶菌酶在陽離子交換介質表面的吸附行為由于溶菌酶核磁信號在一維氫譜上嚴重重疊無法指認各個殘基。因此本文擬通過二維氫譜中化學位移全相關譜TOCSY譜(Totalchemicalshiftcorrelationspectroscopy)來獲得殘基信息。TOCSY譜可以描述在蛋白肽鏈內具有α-H、β-H間偶極偶合相關的氫信號，其優點是以交叉峰的形式指認各個殘基，譜峰很少重疊、分辨率較高。利用該技術，本文繼續考察了溶菌酶在陽離子交換介質表面的吸附行為，根據各殘基峰強度可以獲知溶菌酶上氫質子被氘取代的程度，從而判斷出蛋白質的去折疊程度。在以上溶液實驗的基礎上，。對比吸附態與天然態溶菌酶的TOCSY譜(圖3)，顯示吸附態時溶菌酶殘基酰胺氫信號的丟失要多于天然態。說明吸附到陽離子交換介質上的溶菌酶暴露出更多的殘基在重水溶劑里；同時，也說明溶菌酶緊密的球狀蛋白開始松解，由此可推測陽離子交換介質表面的靜電基團是介導溶菌酶去折疊行為的主要機制。為詳細了解溶菌酶蛋白各區域在陽離子交換介質表面的去折疊行為，對各個殘基酰胺氫的交聯峰進行歸屬和回歸分析(圖4)。吸附態和天然態殘基峰強度對比顯示，吸附態殘基峰強度明顯比天然態殘基弱，說明吸附態暴露出更多殘基在溶液中。但是，絕大部分的殘基信號保留下來，說明溶菌酶的結構只是發生局部去折疊，例如一些二級結構α-helix、β-sheet(H1、H2、H3、H4、H5、H6、S2，S1除外)能夠保持其原有結構。此外，不同的結構片段呈現出不同的氫信號保護程度，一些無規則卷曲(Coil，bend，andturn)片段的氫信號就更容易失去(如69-75、80-95和115-120)，相反，二級結構域對氫的信號保護則更好。以上研究表面，吸附態溶菌酶無規則片段去折疊程度更大，而二級結構域受到保護。這種由靜電作用介導的蛋白質去折疊與由疏水作用和變性劑介導的去折疊區域有許多相似之處,如二級結構被保護，無規則結構去折疊等。但去折疊程度明顯不同，對比本課題組研究溶菌酶在苯基瓊脂糖疏水介質表面的去折疊發現，靜電配基介導的溶菌酶殘基信號損失要明顯少于后者，這說明靜電作用導致的蛋白去折疊要弱于疏水作用對蛋白的破壞程度。

2.3溶菌酶與陽離子交換介質的作用位點分析詳細了解蛋白質分子與介質相互作用中起決定作用的綁定位點，對于深刻理解層析過程中蛋白質與層析介質微觀作用機理以及吸附劑的選擇、設計具有重要意義。離子交換色譜利用蛋白質與離子交換介質之間的靜電作用力的不同達到分離純化。對于陽離子交換介質，由于帶負電荷，主要由蛋白表面帶正電荷的氨基酸與其發生靜電作用。此外，研究者利用核磁共振檢測到蛋白質與固體介質的作用界面的殘基酰胺氫信號保護程度大于溶液中殘基。因此，可以確定蛋白與陽離子交換介質的作用位點主要有3個特征：1)帶正電荷的氨基酸；2)蛋白表層的氨基酸；3)接觸面酰胺氫信號被保護的氨基酸。本研究擬依據這3個特征確定溶菌酶與陽離子交換介質的結合位點。首先，為確定蛋白表層帶正電荷的氨基酸殘基，通過計算機分子模擬計算軟件(Accelrysdiscoverystudio)里的Delphi模塊計算出每個殘基的平均凈電勢，篩選出平均靜電勢大于零為帶正電荷的氨基酸殘基，然后，再從中篩選出SASA大于10%的殘基,SASA大于10%的殘基被認為是溶劑可及殘基(圖5)。

其次，通過公式(2)篩選出被接觸面保護的氨基酸。其中，I%為吸附前后蛋白的強度損失程度，當I%值大于零時即為酰胺氫信號被保護的殘基，如圖6A。圖6B為溶菌酶的氨基序列，其中被接觸面保護的殘基以斜體下劃線標出，盡管這些氨基酸殘基序列并不依次相連，但在蛋白三維結構中，大部分殘基在同一表面。最終，取帶正電荷的表層氨基酸與氫信號被保護的氨基酸之間的交集，篩選出溶菌酶與陽離子交換介質的作用位點分別為Lys33、Arg114、Arg68(圖7)，這與研究者用熒光標記賴氨酸測定的溶菌酶與相同陽離子交換介質(即SPSepharoseFF)的作用位點Lys33一致。但由于熒光標記法只能標記賴氨酸一種帶正電荷的殘基，僅獲得了賴氨酸的綁定信息。此外，另一類常用技術是通過比較定點突變蛋白的保留時間差異來判斷介質表面的綁定位點[5,28-29]，由于需要復雜的基因工程技術來構建蛋白質突變株，這些方法普遍存在如下問題：1)尋找存在突變株的蛋白較為困難，導致可研究的蛋白種類非常有限；2)沒有考慮當引入兩個或多個取代殘基時蛋白三維結構改變對實驗結果的影響。相比而言，本研究利用H/D交換結合核磁共振技術，能夠彌補上述缺陷可獲得所有殘基包括帶同樣正電荷的精氨酸和組氨酸等的作用信息，并實現了原位標記、實時、快速的表征介質表面各種蛋白去折疊程度的信息。

3結論

本研究利用氫氘交換結合NMR技術表征了蛋白在離子交換介質上的吸附過程。結果顯示，當溶菌酶吸附到介質表面之后，不同結構片段的去折疊程度不同，無規則卷曲(Coil，bend，andturn)片段酰胺氫信號更易失去即去折疊明顯，二級結構域(α-helix，β-sheet)對酰胺氫信號保護較好即去折疊較弱，表明靜電介導的蛋白去折疊呈局部分布。通過蛋白表面靜電勢模擬計算結合氫氘標記的蛋白核核磁數據分析確定了溶菌酶與陽離子交換介質的作用位點為Lys33、Arg114、Arg68。本研究提供了一條原位實時捕捉多孔介質內的蛋白結構變化信息的新途徑，對于深刻理解層析過程中蛋白與層析介質微觀作用機理具有重要意義，也為其他領域中蛋白質與生物材料之間微觀界面研究提供了新的技術手段。

作者：王康郝冬霞齊樹亭馬光輝單位：河北工業大學海洋科學與工程學院中國科學院過程工程研究所生化工程國家重點實驗室