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【摘要】

目的：通過基因芯片技術(shù)檢測(cè)具有不同轉(zhuǎn)移潛能的前列腺癌細(xì)胞系LNCaP和C4－2中表達(dá)差異的基因，尋找前列腺癌轉(zhuǎn)移相關(guān)基因。方法：采用TRIzol一步法提取LNCaP和C4－2細(xì)胞的總RNA，并純化mRNA，反轉(zhuǎn)錄合成熒光分子標(biāo)記的cDNA探針，與基因芯片雜交。采用GenepixPro6．0圖像分析軟件進(jìn)行芯片圖像分析，把圖像信號(hào)轉(zhuǎn)化為數(shù)字信號(hào)，然后以差異大于等于2倍的標(biāo)準(zhǔn)來(lái)確定差異表達(dá)基因。結(jié)果：在LNCaP與C4－2細(xì)胞中，表達(dá)差異的基因共有417個(gè)，上調(diào)基因301個(gè)，下調(diào)基因116個(gè)。分析顯示差異表達(dá)基因分別與細(xì)胞增殖、代謝、細(xì)胞因子、細(xì)胞轉(zhuǎn)移等相關(guān)，其中發(fā)現(xiàn)7個(gè)基因與腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移相關(guān)，分別為EGFR、EGF、PIK3R1、CyclinE、HYAL1、GNAI1、AZGP1。結(jié)論：篩選出LNCaP與C4－2細(xì)胞系中7個(gè)轉(zhuǎn)移相關(guān)基因，為進(jìn)一步研究前列腺癌轉(zhuǎn)移機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。

【關(guān)鍵詞】

基因芯片；LNCaP細(xì)胞；C4－2細(xì)胞；轉(zhuǎn)移；前列腺癌

前列腺癌是男性常見的泌尿生殖系統(tǒng)惡性腫瘤之一，在歐美國(guó)家，男性所有腫瘤中PC占了30％，病死率僅次于肺癌居第二［1］。隨著我國(guó)人民生活水平的提高、生活方式的改變及男性平均壽命的延長(zhǎng)，前列腺癌的發(fā)病率不斷上升。有學(xué)者［2］在1941年發(fā)現(xiàn)前列腺癌是一種雄激素依賴的惡性腫瘤，雄激素通過與前列腺癌細(xì)胞的雄激素受體（androgenreceptor，AR）結(jié)合激活下游的分子信號(hào)通路，促進(jìn)前列腺癌增殖?？剐奂に刂委熆裳泳徢傲邢侔┑倪M(jìn)展，改善患者生活質(zhì)量［3］。因此，手術(shù)及藥物去勢(shì)等雄激素剝奪相關(guān)的內(nèi)分泌治療對(duì)前列腺癌患者有顯著療效。然而，約90％的前列腺癌患者在接受雄激素剝奪治療12～24個(gè)月后會(huì)對(duì)內(nèi)分泌治療發(fā)生抵抗，進(jìn)展為雄激素非依賴的去勢(shì)抵抗型前列腺癌，腫瘤進(jìn)展加快，發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，因缺乏有效的治療措施最終導(dǎo)致患者死亡［4－5］。目前有效控制腫瘤的進(jìn)展，防止腫瘤發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移是前列腺癌研究領(lǐng)域的熱點(diǎn)，因此，明確前列腺癌轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制，尋找有效的治療靶點(diǎn)，對(duì)前列腺癌的治療尤為迫切。本研究通過基因芯片技術(shù)，尋找具有低轉(zhuǎn)移潛能的前列腺癌細(xì)胞LNCaP及其衍生的雄激素非依賴的轉(zhuǎn)移細(xì)胞系C4－2間表達(dá)差異的基因，并分析與轉(zhuǎn)移相關(guān)的差異基因，為探索前列腺癌轉(zhuǎn)移相關(guān)分子機(jī)制提供一定的線索和研究基礎(chǔ)。

1材料與方法

1．1材料前列腺癌細(xì)胞系LNCaP、C4－2購(gòu)自上海細(xì)胞庫(kù)；人類全基因組芯片購(gòu)自Agilent公司；胎牛血清購(gòu)自Hyclone公司；TRIzol購(gòu)于Invitrogen公司，RNA反轉(zhuǎn)錄試劑購(gòu)自TaKaRa公司；總RNA的純化試劑盒及cRNA純化試劑盒購(gòu)自QIAGEN公司；基因表達(dá)雜交試劑盒（貨號(hào)5188－4242），RNASpikeInKit試劑盒（貨號(hào)：5188－5282）購(gòu)自Agilent公司。

1．2細(xì)胞培養(yǎng)與總RNA提取及純化LNCaP、C4－2前列腺癌細(xì)胞用含100ml／L胎牛血清的1640培養(yǎng)基，置于37℃、50ml／LCO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。細(xì)胞匯合度達(dá)到80％～90％融合后，PBS液體洗兩遍，加入TRIzol反復(fù)吹打，充分裂解細(xì)胞，加入氯仿室溫靜置15min，4℃，12000r／min離心10min，吸取上清，加入異丙醇靜置10min后，4℃，12000r／min離心10min，75％酒精洗滌沉淀，離心，室溫靜置5min，加入DEPC處理水溶解RNA，－70℃保存。抽提總RNA的濃度和質(zhì)量采用分光光度計(jì)及瓊脂糖膠電泳測(cè)定?？俁NA純化的詳細(xì)步驟嚴(yán)格按照QIAGENRNeasyMiniKit操作。

1．3熒光標(biāo)記cRNA合成及純化嚴(yán)格遵循Agilent芯片表達(dá)分析實(shí)驗(yàn)方法進(jìn)行雙鏈cDNA的合成、熒光標(biāo)記cRNA的合成以及cRNA的片段化等過程。cDNA第一鏈和第二鏈以randomPromoterprimer為引物配制cDNA合成體系運(yùn)用一步法合成；cRNA以熒光染料標(biāo)記后，以QIAGENRNAeasyminikit純化cRNA，以分光光度計(jì)分析cRNA濃度（具體操作步驟詳見AgilentcDNA表達(dá)譜芯片操作指南）。

1．4芯片雜交cRNA片段化后加入HybridizationBuffer混勻配制雜交液后滴加于芯片上雜交過夜。芯片雜交后的洗滌、染色過程遵照標(biāo)準(zhǔn)的Agilent表達(dá)譜芯片實(shí)驗(yàn)指南進(jìn)行。

1．5數(shù)據(jù)分析芯片結(jié)果采用AligentScanner來(lái)獲取圖像，通過Imagene轉(zhuǎn)化為數(shù)值后應(yīng)用Genespring分析軟件將數(shù)值進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化，取得Ratio值。一般認(rèn)為Ratio值在0．5～2．0范圍內(nèi)的基因不存在顯著的表達(dá)差異，而在該范圍之外的基因被認(rèn)為表達(dá)出現(xiàn)顯著改變。因此，實(shí)驗(yàn)結(jié)果將兩個(gè)細(xì)胞株之間差異表達(dá)平均倍數(shù)≥2．0倍或≤0．5者篩選出來(lái)，作為上調(diào)和下調(diào)的候選研究基因。對(duì)差異表達(dá)基因的分析借助于GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)、GO分析等完成。

2結(jié)果

2．1mRNA基因表達(dá)圖譜分析C4－2與LNCaP細(xì)胞比較，基因表達(dá)上調(diào)2倍的mRNA基因有301個(gè)，基因下調(diào)2倍的mRNA基因有116個(gè)。芯片雜交散點(diǎn)圖如圖1所示，圖中每一個(gè)數(shù)據(jù)點(diǎn)代表芯片上一個(gè)基因點(diǎn)的雜交信號(hào)，越偏離兩條線的點(diǎn)，表示此基因在C4－2與LNCaP的差異越明顯。在兩條線之內(nèi)或者重合的點(diǎn)，表示此基因在兩株細(xì)胞系中無(wú)明顯差異。

2．2轉(zhuǎn)移相關(guān)差異表達(dá)基因分析結(jié)果結(jié)合基因芯片的結(jié)果，通過GO富集分析發(fā)現(xiàn)EGFR、EGF、PIK3R1、CyclinE、HYAL1、GNAI1、AZGP1可能與前列腺癌轉(zhuǎn)移相關(guān)，結(jié)果見表1。

3討論

早期前列腺癌患者的10年生存率較高，但一旦發(fā)生轉(zhuǎn)移預(yù)后不佳［6］。遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移以骨骼和淋巴結(jié)為常見，70％～80％患者最終出現(xiàn)骨轉(zhuǎn)移。因此明確前列腺癌轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制具有重要意義。實(shí)驗(yàn)中我們選用前列腺癌細(xì)胞LNCaP與其轉(zhuǎn)移性亞型C4－2細(xì)胞作為研究對(duì)象，二者有相同的基因背景，LNCaP是原發(fā)性前列腺癌細(xì)胞株，轉(zhuǎn)移性弱，C4－2轉(zhuǎn)移能力強(qiáng)。本研究通過基因芯片技術(shù)快速、準(zhǔn)確地分析數(shù)以千計(jì)的基因組信息，檢測(cè)表達(dá)差異的分子，尋找前列腺癌轉(zhuǎn)移相關(guān)的關(guān)鍵分子，為前列腺癌轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制研究提供一定的理論基礎(chǔ)。表皮生長(zhǎng)因子（EGF）是一種細(xì)胞調(diào)節(jié)多肽。研究表明EGF具有促進(jìn)細(xì)胞分裂增殖的作用。它通過靶細(xì)胞膜上的EGFR使受體酪氨酸殘基磷酸化而引發(fā)細(xì)胞的增殖效應(yīng)。研究顯示EGFR過表達(dá)于多種腫瘤，其介導(dǎo)的信號(hào)傳導(dǎo)影響腫瘤細(xì)胞的增殖、凋亡、浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移及血管生成［7－8］，與腫瘤惡性程度、轉(zhuǎn)移、放化療敏感度下降密切相關(guān)，許多阻滯和下調(diào)EGFR的方法被用來(lái)抑制腫瘤增殖以改善預(yù)后［9］。已有研究證實(shí)EGFR過表達(dá)與前列腺癌從激素依賴性進(jìn)展至激素非依賴性相關(guān)［10］。本研究中發(fā)現(xiàn)C4－2細(xì)胞中EGF、EGFR表達(dá)異常增高，提示EGFR信號(hào)通路在前列腺癌轉(zhuǎn)移過程中可能發(fā)揮了重要的作用。PIK3R1又稱p85α，有研究已證實(shí)p85α是AR異常激活和前列腺癌激素抵抗性進(jìn)展所必須的［11］。CyclinE是重要的細(xì)胞周期正性調(diào)節(jié)因子，CyclinE過表達(dá)使細(xì)胞G1期進(jìn)程縮短，提前進(jìn)入S期，加快轉(zhuǎn)換的步伐和增加輪回?cái)?shù)，造成細(xì)胞的無(wú)限增殖－腫瘤的形成。CyclinE與腫瘤血管的生成和腫瘤的轉(zhuǎn)移關(guān)系密切［12］。因此CyclinE異常表達(dá)與前列腺癌等腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，并且可能在前列腺癌的進(jìn)展中發(fā)揮著重要作用。最新的研究顯示G蛋白偶聯(lián)受體家族成員GNAI1可以抑制腫瘤的遷移和侵襲［13］，本研究發(fā)現(xiàn)C4－2細(xì)胞中GNAI1低表達(dá)，提示GNAI1在前列腺癌進(jìn)展過程中，其抑制腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移的功能下降，導(dǎo)致腫瘤發(fā)生轉(zhuǎn)移。有研究顯示AZGP1的表達(dá)降低與胃癌的預(yù)后不良密切相關(guān)，他們的研究表明AZGP1可以作為一個(gè)候選的抑癌基因［14］。HYAL1編碼透明質(zhì)酸酶在乳腺癌細(xì)胞及組織中高表達(dá)，促進(jìn)腫瘤的生長(zhǎng)、增殖、侵襲轉(zhuǎn)移能力［15］。此外，透明質(zhì)酸酶在胰腺癌中異常高表達(dá)預(yù)示著患者預(yù)后不良［16］。

本課題通過應(yīng)用基因芯片技術(shù)，比較具有相同遺傳背景而轉(zhuǎn)移特性不同的兩株前列腺癌細(xì)胞系中基因的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)7個(gè)前列腺癌轉(zhuǎn)移相關(guān)基因，并對(duì)各個(gè)基因在腫瘤轉(zhuǎn)移中的研究進(jìn)行了探討，為前列腺癌轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制提供了重要的理論基礎(chǔ)。

作者：吳磊 惠慧 雒小佳 樊利妮 王浩 王凱 單位：陜西省腫瘤醫(yī)院 西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院