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作者：王潔夏振娜車愛萍袁伯俊陸國才單位：第二軍醫(yī)大學新藥評價中心上海

1987年美國國立衛(wèi)生研究院將生物標志物定義為生物體或樣品可測出的由外來化合物導致的細胞學或生物化學組份過程、結構或功能的變化。毒理學生物標志物是機體對化學物質毒性劑量暴露后的生物學變化，可特異性地反映毒性效應。據(jù)美國食品藥品管理局估計，約有30%的新藥就是因嚴重的安全性問題而導致研發(fā)失敗，故毒理學在新藥研發(fā)中起著越來越重要的作用，它可在創(chuàng)新藥物的研發(fā)早期，對所合成的系列新化合物實體進行毒性篩選，從而發(fā)現(xiàn)和淘汰因毒性問題而不適于繼續(xù)研發(fā)的化合物，而生物標志物能敏感有效地反映出生物體因藥物作用而發(fā)生嚴重損傷之前的生物變化，并能準確評估生物體所處的不利狀態(tài)及其潛在危害，為可能發(fā)生的嚴重毒性損害提供早期警報，因此在新藥研發(fā)過程中，生物標志物的作用功不可沒。本文討論新近發(fā)現(xiàn)的消化系統(tǒng)毒理學生物標志物。

1非腫瘤毒理學生物標志物

1．1胃腸道

1．1．1腸脂肪酸結合蛋白腸脂肪酸結合蛋白(intestinalfattyacidbindingprotein，I-FABP)是脂肪酸結合蛋白(fattyacidbindingprotein，F(xiàn)ABP)中的一種，僅存在于腸道黏膜，含量豐富，占細胞蛋白總量的2%～3%，具有較好的器官特異性，可以作為缺血性腸炎的血漿生物標志物。I-FABP在黏膜中的含量最豐富，絨毛處的含量高于陷窩處的含量。由于黏膜層對缺血最為敏感，在腸缺血的早期或炎癥局限黏膜下層時，黏膜層就已有改變。因此，黏膜層酶的釋放往往較肌層的酶早。在正常人血清中，I-FABP的含量微乎其微，當藥物造成腸系膜血管收縮或內臟血流量降低時，可引起缺血性腸炎，此時I-FABP能較早釋放，且在缺血時細胞膜的通透性較大，其分子可以通過細胞膜而釋放入血漿。當腸道缺血發(fā)生后15min血清中I-FABP迅速增加。大多數(shù)血清酶為熱不穩(wěn)定酶，測定時需保持酶的活性，而血清I-FABP在室溫下24h相當穩(wěn)定，可保持活性的95%，并且與傳統(tǒng)血清學指標相比，I-FABP具有出現(xiàn)早、特異性強的特點。因此I-FABP是早期診斷藥物引起的腸缺血的敏感而特異性的指標。

1．1．2二胺氧化酶二胺氧化酶(diamineoxidase，DAO)是人類和哺乳動物小腸黏膜上層絨毛中具有高度活性的細胞內酶，在組胺和多種多胺代謝中起作用，其活性與黏膜細胞的核酸和蛋白合成密切相關，能夠反映腸道機械屏障的完整性和損傷程度。據(jù)相關報道，血液中DAO的活性與小腸黏膜絨毛中DAO的活性以及由抗癌藥物引起的小腸黏膜損傷有顯著的相關性。Moriyama等將大鼠分為抗癌藥物S-1組和FCD組。其中S-1組給予1-(2-四氫呋喃)-5-氟尿嘧啶、5-氯-2，4-二羥基吡啶和氧嗪酸鉀，3種藥物比率為1∶0．4∶1。FCD組給予1-(2-四氫呋喃)-5-氟尿嘧啶和5-氯-2，4-二羥基吡啶，兩種藥物比率為1∶0．4。氧嗪酸鉀為5-氟尿嘧啶引起胃腸黏膜損傷的保護劑。連續(xù)給藥7d，結果發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)CD組大鼠空腸黏膜面積明顯小于S-1組，F(xiàn)CD組的大鼠血漿中DAO的活性比S-1組大鼠血漿中DAO的活性顯著降低。病理組織切片顯示，F(xiàn)CD組大鼠空腸黏膜的絨毛發(fā)生萎縮，但在S-1組并沒有觀察到此現(xiàn)象。因此DAO是一種非常敏感的血漿生物標志物，在定量評價由5-氟尿嘧啶等癌癥藥物引起的小腸黏膜損傷中非常有用。

1．2肝臟

1．2．1?；撬岣味拘允撬幬锍Ｒ姷牟涣挤磻?，當毒性物質對肝臟薄壁組織產生損傷時，肝細胞會發(fā)生凋亡或壞死，胞漿酶如谷丙轉氨酶(alaninetrans-aminase，ALT)、山梨醇脫氫酶，有時線粒體標記酶如鳥氨酸氨甲酰轉移酶(ornithinecarbamoyltrans-ferase，OCT)會被釋放進入血液。?；撬崾侨梭w內含量最豐富的一種氨基酸。牛磺酸濃度的變化通常隨應激狀態(tài)(如滲透壓的變化，缺氧，長期照明光感受器，充血性心力衰竭，細胞增殖，或大腦發(fā)育等)的變化而變化。Ghandforoush和Mashayekh通過高效液相色譜法測定217名對乙酰氨基酚陽性患者和100名對乙酰氨基酚陰性患者以及90名正?；颊唧w內的血漿?；撬釢舛?，結果發(fā)現(xiàn)，給予對乙酰氨基酚的患者的?；撬岬钠骄帩舛?26．4±1．6mg/L)明顯高于對照組(5．6±0．2mg/L)，因此藥物對肝臟有毒性時，肝臟合成牛磺酸增加，并從受損的肝細胞滲出，導致血漿和尿液中牛磺酸的濃度增加。

1．2．2山梨醇脫氫酶山梨醇脫氫酶(sorbitolde-hydrogenase，SDH)可以氧化還原山梨醇，果糖以及NADH。它廣泛分布于機體的各個組織中，主要是存在于肝臟、腎臟和精囊的胞漿和線粒體中，在嚙齒類動物以及人體中，它是表征急性肝損傷的具體指標。由四氯化碳引起的肝小葉壞死、烯丙醇引起的門靜脈周圍壞死、α-荼基異硫氰酸鹽(α-naphthyliso-thiocyanate，ANIT)引起的膽管壞死等可以用14種血清生化測試預測出來。谷氨酸脫氫酶(glutamicdehydrogenase，GLDH)、SDH、ALT是這14種測試分析中最有價值的幾種。GLDH和ALT的活性分析可以很好的預測由ANIT和烯丙醇引起的損害。SDH的活性是肝毒性的一個標志，在評價2，3，7，8-四氯苯二噁英(tetrachlorodibenzodioxin，TCDD)對肝功能的影響中，成年雄性恒河猴單劑量遞增法口服給予TCDD，每只恒河猴都用它自身的SDH、ALT和GGT做對照，時間為給藥前4周以及給藥后17周。SDH和ALT的活性在所有給予TCCD的動物中都有提高。在另一項研究中，比格犬劑量遞增法給藥殺撲磷(methidathion)，沒有發(fā)現(xiàn)明顯的死亡以及不良的臨床癥狀，但在所有給予殺撲磷的比格犬中(雄性和雌性)，血清中膽汁酸和酶的活性(ALT，SDH和堿性磷酸酶)有統(tǒng)計學意義的增加。因此SDH是一個臨床前肝毒性生物標志物，血清SDH活性是否可以增加ALT活性有待進一步研究。

2腫瘤毒理學生物標志物

由于個體差異的存在，某些藥物在體內的代謝速率和代謝方式會有不同，對于目標靶點的起效劑量也有不同，機體對藥物產生的反應也不同，有些藥物及其代謝物可能會與DNA等靶點結合，產生基因毒性，并可能導致腫瘤的發(fā)生。因此血液中的蛋白質和DNA可以作為驗證藥物是否具有致癌性的生物標志物。

2．1肝臟

2．1．1羧酸酯酶-2羧酸酯酶-2(carboxylesteras-es-2，CE-2)是羧酸酯酶亞家族中的成員，由550個氨基酸組成，相對分子質量為61807。血清中的CE-2主要在肝臟中合成，并通過高爾基體分泌到血循環(huán)中。最近研究表明，CE-2可作為肝癌的新標志物。肝臟惡性腫瘤患者血清中CE-2含量減少，而結腸癌及其它腫瘤患者血清中CE-2含量基本無改變。CE-2在大腸癌組織表達量隨著病情的加重逐漸減少，但血清中CE-2的量和大腸癌病情無關;其他腫瘤，包括乳腺癌、肺癌、舌血管平滑肌肉瘤、非霍杰金淋巴瘤，血清中CE-2的量和正常人基本相似。與此相反，肝癌患者血清中CE-2表達量比正常人顯著減少，提示肝癌病人血清中CE-2含量比正常人顯著減少可能是特異的，有望作為肝臟腫瘤特異的標志物。

2．1．2轉化生長因子β1轉化生長因子β1transforminggrowthfactor-β1，TGF-β1)為公認的致肝纖維化最主要的細胞因子之一，其貫穿肝纖維化的整個過程，主要由激活的肝枯否細胞、肝星狀細胞(hepaticstellatecells，HSC)等以自分泌、旁分泌的形式產生，可在局部形成高濃度。而正常肝組織一般無或僅有極少TGF-β1存在，在所有類型細胞中，TGF-β1均以無活性的形式合成和分泌，其活性形式為同源二聚體?；罨蟮腡GF-β1必須與其受體結合才能表現(xiàn)出相應生物活性，如使肝星狀細胞轉化為肌成纖維細胞(myofibroblast，MFB)等［11］。在慢性肝炎、肝硬化組織中，由于病毒持續(xù)存在，引起免疫損傷和炎癥反應，刺激間質細胞分泌TGF-β1，它是最強的促纖維生成的細胞因子，不但參與維持HSC活化表型，而且刺激活化的HSC合成、分泌大量的細胞外基質(extracellu-larmatrix，ECM)及ECM降解蛋白酶抑制劑，抑制ECM降解，增加ECM沉積。TGF-β1作用的結果是ECM的合成增多，導致肝纖維化形成。在57例肝硬化患者肝組織中［12］TGF-β1蛋白表達的陽性率為98．38%，而正常肝組織未見陽性表達，差異有統(tǒng)計學意義，且TGF-β1表達的陽性信號均位于肝細胞胞漿中。

2．1．3組織多肽特異性抗原組織多肽特異性抗原(tissuepolypeptidespecificantigen，TPS)是從組織多肽抗原(tissuepolypeptideantigen，TPA)中純化而來，其實質是細胞角蛋白18片段上的M3決定簇，在細胞周期的S晚期和G2期，伴隨著DNA、蛋白質的合成，TPS合成并于細胞分裂后不久釋放入血或體液中。所以血清TPS水平常反映腫瘤細胞的分裂增殖活性。研究發(fā)現(xiàn):TPS僅與腫瘤大小有關。Duller等分別對69例肝細胞癌患者，57例健康人，56例慢性肝炎患者和49例肝硬化患者應用單克隆TPS免疫放射分析法測定其血清TPS水平，同時還測定了甲胎蛋白(alphafetoprotein，AFP)值。結果顯示:TPS血清水平僅高于正常對照組，與肝硬化及肝炎組無顯著差異;TPS與AFP無顯著相關性;血清TPS僅與腫瘤大小之間存在顯著相關性;AFP與腫瘤大小，門脈癌栓及腫瘤分化程度之間存在顯著相關性。血清TPS與肝細胞癌腫瘤侵襲性之間無顯著相關性。但與肝功能受損程度相關性顯著，導致在部分肝硬化患者或肝炎患者中出現(xiàn)了高水平表達。因此，TPS雖然尚不能夠獨立診斷肝細胞癌，但是對肝病患者血清TPS的升高應注意結合其它相關的臨床指標加以具體分析，以便能夠達到早期診斷肝細胞癌的目的。

2．2胰腺

2．2．1再生基因蛋白Reg4(regeneratinggene-4，Reg4)Reg4是再生基因家族成員之一，編碼17kD的分泌性蛋白。Reg4基因是2001年由Har-tu-pee最先報道的基因，目前是Reg家族中最短小的一員，定位于染色體1p12～13-1，人類的Reg1和Reg3均定位于染色體2p12，但它們亦存在許多共同特性，如序列同源性，在組織表達上的相似性及內含子－外顯子連接處基因結構相似性等。Reg4基因由17557個堿基對構成，包含7個外顯子及6個內含子，由于差異剪接，外顯子并不表現(xiàn)在所有轉錄物中。Reg4的翻譯產物為158個氨基酸的蛋白質，包含一個22氨基酸的信號肽和一個保守的鈣依賴性的糖識別域。Reg4蛋白分子量為17kD，其氨基端呈高度疏水性，且包含一個含22氨基酸的信號序列。應用生物信息學軟件對Reg家族成員進行蛋白序列的比較顯示，Reg4與另外幾個成員Reg1α，Reg1β和Reg3在一級結構上相似性均超過30%，三維結構模擬結果亦相似，說明4個成員在進化上的保守性。Reg4可作用于相鄰的正?；蚰[瘤細胞，與細胞生存、再生、增殖和細胞黏附有關。Reg4在與腫瘤標志物CA19-9相比的實驗中發(fā)現(xiàn)，胰腺癌患者的血清Reg4和CA19-9的AUC沒有顯著性差異。胰腺癌患者組和健康對照組相比，胰腺癌患者的血清Reg4水平要高于健康對照組。這表明血清Reg4可以作為診斷胰腺癌的一個有用指標。

2．2．2S100蛋白S100蛋白存在于各種細胞的細胞質和細胞核中，可參與調節(jié)細胞周期、細胞分化等過程。S100家族屬于鈣離子結合蛋白，在分子結構上具有共同的EF雙螺旋手性結構，含有能與鈣離子高選擇性、高親和性結合的14個氨基酸序列，與鈣離子結合后通過鈣離子信號傳導途徑可在細胞增殖、分化、肌肉收縮、基因表達、分泌及細胞凋亡中發(fā)揮重要作用。S100家族共有23個成員，它們在結構上具有25%～65%的同源性，為低分子質量的酸性蛋白，因其可在100%中性飽和硫酸銨溶液中溶解而被命名為S100蛋白。S100蛋白基因位于4p16，它編碼的蛋白質，除了與Ca2+結合外，還與Zn2+和Mg2+結合。S100蛋白是含有95個氨基酸的蛋白質，是在胎盤中分離發(fā)現(xiàn)的。從那以后，在胃癌、膽囊癌、膀胱上皮以及食管上皮的細胞分化中也同樣發(fā)現(xiàn)。Oliveira等用反轉錄PCR(reversetranscriptionPCR，RT-PCR)和原位雜交試驗證明了有2%的胰腺上皮內瘤-1A(pancreaticintraepitheli-alneoplasia-1A，PanIN-1A)，13%的PanIN-1B，31%的PanIN-2，43%的PanIN-3以及92%的侵襲性胰腺癌都有S100蛋白的表達。這表明S100蛋白的比例在逐漸增加，并且具有顯著性意義。而在正常的胰管中未發(fā)現(xiàn)有S100蛋白的表達。

2．3口腔血清糖蛋白YKL-40YKL-40又名人類軟骨糖蛋白-39(humancartilageglycoprotein-39，HCgp-39)，是哺乳動物18糖蛋白家族中的一員，是一種肝素和甲殼質相結合的凝集酶。在生理條件下，YKL-40可由巨噬細胞、中性粒細胞、軟骨細胞、血管平滑肌細胞分泌，在炎癥相關性疾病特別是多種惡性腫瘤中，YKL-40有高水平的表達。近年來，YKL-40已被發(fā)現(xiàn)是一種潛在的腫瘤血清學新生物標志物?？捎糜谠u估卵巢癌等多種人類惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和預后。有研究證明，YKL-40的含量參數(shù)可以對肺、乳房、前列腺以及腎的癌變做出預測，對口腔癌變也有很好的預測作用。有實驗對口腔癌患者以及健康的志愿者的血漿YKL-40水平做了如下分析:對56名口腔癌患者(35名男性，21名女性，平均年齡61．8歲)以及17名健康志愿者的血清YKL-40濃度作了分析，結果發(fā)現(xiàn)，口腔癌患者的YKL-40水平(平均199．01mg/L)明顯高于健康志愿者。Johansen等在13種不同類型的腫瘤患者(2500例)血清中發(fā)現(xiàn)，YKL-40比其它的腫瘤標志物如表皮生長因子受體2、癌胚抗原、上皮癌抗原、前列腺特異抗原和乳酸脫氫酶等具有更好的特異性。

3展望

在新藥研發(fā)的各個階段發(fā)現(xiàn)和利用生物標志物是一項極具挑戰(zhàn)性研究。在臨床前和臨床研究中仍有很多藥物毒性靶器官缺乏良好的毒理學生物標志物，因此當務之急是結合基因組學、蛋白質組學等前沿學科尋找到與藥物毒性靶器官相對應的生物標志物，對其進行全面的評估，并盡快推廣應用，這樣就可有效地減少藥物研發(fā)風險。