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摘要:為了確保檢測結果準確，提高實驗室檢測能力，采用GB4789.30-2016、miniVIDAS、實時熒光PCR3種方法同時檢測能力驗證樣品中的單增李斯特菌，并對測試結果進行比對分析。結果顯示，所采用的3種方法均能準確鑒定出目標菌，取得滿意結果。3種方法各有優劣，同時使用，綜合判斷，能確保試驗結果準確。

關鍵詞:GB4789.30-2016；miniVIDAS；實時熒光PCR；單增李斯特菌；能力驗證

1前言

實驗室能力驗證是指利用實驗室間比對，按照預先指定的準則評價參加者的能力[1]。中國合格評定國家認可委員會（CNAS）將能力驗證作為評價實驗室技術能力的重要手段之一，與現場評審構成了互為補充的2種能力評價技術[2]。能力驗證作為重要的外部質量評價活動，尋求并參加能力驗證是每個合格評定機構的責任和義務[1]。實驗室將能力驗證用作有效的外部質量保證活動，并將其作為內部質量控制程序的補充，持續監控實驗室檢測能力。單核細胞增生李斯特菌，簡稱單增李斯特菌，屬于革蘭氏陽性菌，是最常見的人畜共患型食源性致病菌之一[3]。人類感染后可導致腸胃炎、敗血癥、腦膜炎、流產等，尤其是孕婦、嬰幼兒、老年人及免疫力低下者更易感染[4]。單增李斯特菌廣泛存在于各類乳制品、蔬菜、肉類等食品中，對人的健康造成了極大的威脅。我國食品安全國家致病菌限量標準中規定熟肉制品及即時生肉制品中不得檢出單增李斯特菌[5]，世界各國及地區也制定了相應的限量標準和食品法規[6]。食品中單增李斯特氏菌的檢測技術則成為食源性疾病預防與控制的關鍵。為了正確評價并提高實驗室的檢測能力和技術水平，湛江出入境檢驗檢疫局技術中心食品實驗室2017年參加了由國家質量監督檢驗檢疫總局水產品檢測重點實驗室（廣州）組織的水產品中單增李斯特菌檢測比對試驗，2018年參加了由中國檢驗檢疫科學研究院測試評價中心組織的食品中單增李斯特菌檢測能力驗證，采用國標法、miniVIDAS、實時熒光PCR3種方法對測試樣品進行檢測，綜合分析，取得滿意結果。現對3種方法檢測單增李斯特菌的結果進行分析總結。

2材料與方法

2.1材料

2.1.1主要培養基和試劑李氏增菌肉湯LB（LB1、LB2）培養基基礎及添加劑、FraserⅠ和FraserⅡ增菌液培養基、PALCAM瓊脂培養基基礎及添加劑、李斯特菌顯色培養基、含0.6%酵母浸膏的胰酪胨大豆瓊脂（TSA-YE）、半固體動力培養基、革蘭氏染液、木糖、鼠李糖、血平板均購自廣州陸橋檢測技術有限公司；單增李斯特菌酶聯免疫檢測試劑盒和VITEK2格蘭氏陽性菌鑒定卡，法國生物梅里埃公司生產；單增李斯特菌核酸檢測試劑盒（熒光PCR法），深圳生科原生物股份有限公司生產。2.1.2主要儀器設備HFsafe-1500LC型生物安全柜（上海力申科學儀器有限公司）；GHP—9160型隔水式恒溫培養箱（上海一恒科學儀器有限公司）；GR110DR型立式高壓蒸汽滅菌器（美國ZEALWA）Y；DM4B型leica數字顯微鏡（徠卡顯微系統（上海）貿易有限公司廣州分公司）。MiniVIDAS全自動熒光免疫分析儀、VITEK2Compact全自動微生物鑒定/藥敏分析系統（法國生物梅里埃公司）；ABIQ6熒光PCR儀（lifetechnologiesTM）。2.1.3試驗樣品2017年水產品中單增李斯特氏菌檢測比對試驗樣品3個，樣品標識分別為：PT64、PT83、PT173；ACAS-PT525（2018）食品中單核細胞增生李斯特菌檢測微生物能力驗證樣品2個，樣品標識分別為18-M697和18-H655。2.1.4試驗用標準菌株對照單核細胞增生李斯特菌（L.monocytogenes），ATCC19111；英諾克李斯特菌（L.innocua），ATCC33090。

2.2方法

2.2.1國標方法按照組織方提供的《參試指導書》進行水化，振搖充分混勻，全部樣品混懸液作為一個整體樣品，按照GB4789.30-2016《食品微生物學檢驗單核細胞增生李斯特氏菌檢驗》[7]進行增菌、分離、初篩及鑒定。檢驗過程中設置陽性及陰性菌株對照。2.2.2miniVIDAS全自動熒光免疫分析儀參照GB/T22429-2008《食品中沙門氏菌、腸出血性大腸埃希氏菌O157及單核細胞增生李斯特氏菌的快速篩選檢驗酶聯免疫法》[8]，從樣品FB1增菌液中取1mL加到9mLFB2增菌液中進行增菌培養。移取1mLFB2增菌液加入到小試管中，置沸水浴中加熱15min，吸取滅活的增菌液0.5mL，加入試劑條中，按照儀器使用規程及試劑盒說明書進行上機操作和判讀結果。檢測過程中按要求設置試劑盒質量控制。2.2.3實時熒光PCR方法按照SN/T1870-2016《出口食品中食源性致病菌檢測方法實時熒光PCR法》[9]進行樣品制備、增菌培養。取1mL李氏增菌肉湯（LB2）加到1.5mL無菌離心管中，按照檢測試劑盒說明書進行模板DNA制備，然后按照儀器使用規程及試劑盒說明書進行上機操作和判讀結果。檢測過程中按標準要求分別設置陽性對照和空白對照。

3結果與分析

3.1國標法

5個樣品中的國標法檢測結果與指定值一致，結果詳見表1。由表1可見，單增李斯特菌和英諾克李斯特菌在PALCAM平板上的菌落特征基本相同，在李斯特顯色平板上菌落特征有不同，前者有模糊圈，后者無。單增李斯特菌和伊氏李斯特菌在PALCAM平板上的菌落特征不同，可以區分，但在李斯特顯色平板上菌落特征一樣。在兩種平板質量達到要求的前提下，兩種平板結合是可以區分這幾種李斯特菌的。單增李斯特菌和英諾克李斯特菌木糖、鼠李糖生化反應結果相同，單增李斯特菌和伊氏李斯特菌（L.ivanovii）木糖、鼠李糖生化反應結果不同。全自動微生物鑒定系統（VITEK2）有時不能區分單增李斯特菌和英諾克李斯特菌。本研究中，樣品18-M697鑒定顯示為極好的鑒定，生物編號142200224733621，結果為99%L.innocua。樣品18-H655的鑒定結果顯示為低分辨率，不能區分單增李斯特菌和英諾克李斯特菌，人工選擇結果為99%L.monocytogenes，生物編號142200224733621，和判定為英諾克李斯特菌的菌株有同樣的生物編號。單增李斯特菌、英諾克李斯特菌和伊氏李斯特菌在血平板上有不同的溶血反應，可以很好的區分。綜合平板菌落特征、生化鑒定和溶血試驗判定結果。

3.2miniVIDAS全自動熒光免疫分析

儀5個樣品中的miniVIDAS檢測結果與指定值一致，結果見表2。由表2可見，單增李斯特菌酶聯免疫檢測試劑盒能快速準確地對單增李斯特菌進行初篩。miniVIDAS檢測的特點是只要增菌液存在目標菌，不需純培養即可檢出，但無法判斷目標菌的死活，陽性結果需按國標法進一步確證，并報告結果。

3.3實時熒光PCR方法

5個樣品的熒光PCR檢測結果與指定值一致，結果見表3、圖1、圖2。由表3可見，單增李斯特菌核酸檢測試劑盒（熒光PCR法）能快速準確地對單增李斯特菌進行初篩。實時熒光PCR檢測的特點是靈敏度高，特異性好，快速高通量，是很好的食源性病原菌初篩方法。若選擇增菌肉湯進行初篩，24h內可以有初篩結果；若選擇平板分離得到的菌落進行檢測，72h內可以得到比較準確的檢測結果。

4結論

能力驗證結果分析表明，國標法是經典的檢測方法，但檢測周期長，過程復雜，對檢驗人員的檢測技術要求高。全自動熒光酶聯免疫法和實時熒光PCR法檢測都具有簡單快速、檢測限低、靈敏度高、特異性好及不需純培養即可檢出等特點，是很好的初篩方法，但不排除存在死菌等其他原因造成的假陽性結果，有時也會出現位于臨界點不好判定的結果，需重做或經過國標法確證才能報告結果。在能力驗證中，組織方都會添加一種甚至幾種干擾菌，加大了檢測難度[10]。用國標法檢驗，可能出現未挑中目標菌落或目標菌落生化反應不典型等情況，導致未檢出，出現不滿意結果。在實驗室條件允許的情況下，3種方法有機結合，綜合判斷，可確保檢測結果的準確性。

參考文獻

[1]CNAS-RL02：2018《能力驗證規則》[S].

[2]席靜，張思群，劉靜宇，等.論能力驗證活動對實驗室能力建設的作用和意義[J].中國衛生檢驗雜志，2011，21（6）：1576-1578.

[6]現代食品微生物學第七版[M].何國慶，丁立孝，宮春波主譯.北京：中國農業大學出版社，2008：510-511.

[7]食品衛生微生物學檢驗單核細胞增生李斯特氏菌檢驗[S].

[8]食品中沙門氏菌、腸出血性大腸埃希氏菌O157及單核細胞增生李斯特氏菌的快速篩選檢驗酶聯免疫法[S].

[9]出口食品中食源性致病菌檢測方法實時熒光PCR法[S].

[10]張艷超，史永剛，衛佳歡，等.3種方法檢測食品中沙門菌能力驗證結果分析[J].檢驗檢疫學刊，2016，26（3）：14-17.

作者：丁秀瓊 楊勁 劉驍 鄭俏慧 林锏銳 龐曉林 單位：湛江出入境檢驗檢疫局檢驗檢疫技術中心