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《生物技術雜志》2014年第二期

1材料和方法

1.1材料

1.1.1實驗材料釀酒酵母Y187(Matα，trp1－901，leu2－3，112，ura3－52，his3－200)，DH5α(supE44，Δlac，U169，hsdR17，recA1，en-dA1，gyrA96，thi21，relA1)，pPIC9K和pADH1均為作者實驗室保存。

1.1.2試劑SacⅠ、ClaⅠ、XbaⅠ等限制酶，T4DNA連接酶和PCR產物純化試劑盒由北京全式金生物技術有限公司提供。

1.1.3培養基LB培養基:1%胰蛋白胨，0.5%酵母提取物，0.5%氯化鈉，pH7.0。YPDA培養基:1%酵母提取物，2%多價蛋白胨，2%葡萄糖，0.003%腺嘌呤，pH6.5。YPD培養基:1%酵母提取物，2%多價蛋白胨，2%葡萄糖，pH6.5。1.2方法

1.2.1相關基因的克隆和序列分析以質粒pPIC9K為模板，以F(s):5’－CGGGAGCTCAT-GAGATTTCCTTCAATTTTTACT－3’和R(s):5’－GGCATCGATCGGATCCAGCTTCAGCCTCTCTTTTCT－3’為引物擴增信號肽編碼序列。以釀酒酵母基因組為模板，以F(agg):5’－GGGGAATTCTCTAGAGGTGGTGGTGGTTCTCAT-CATCATCATCATCATAGCGCCAAAAGCTCTTTTAT－3’和R(agg):5’－GGGGCATATGTTTGATTATGTTCTTTCTATTTGAAT－3’為引物擴增錨定序列。上游引物F(agg)中下劃線堿基序列依次是編碼EcoRⅠ和XbaⅠ識別序列，黑體部分是引入的Gly4Ser連接肽和6×HisTag，連接肽的引入以減少蛋白折疊的空間位阻效應，His標簽的引入為展示蛋白(用抗His標簽抗體檢測)的檢測和純化(親和層析柱)提供了方便;下游引物中下劃線部分編碼NcoⅠ的識別序列。以pEGFP－C1為模板，以F(gfp):5’－TCCCCCGGGATGGTGAGCAAGGGCGAG-GAGC－3’和以R(egfp):5’－GCTCTAGACTTGTA-CAGCTCGTCCATGCCGA－3’為引物擴增EGFP編碼序列，引物中下劃線分別編碼XbaⅠ和SmaⅠ位點。信號肽，凝集素和綠色熒光蛋白的編碼序列的PCR擴增條件為:94℃預變性4min，94℃變性30s，58℃退火40s，72℃延伸1～3min，72℃延伸7min，共30個循環。序列分析由上海生物工程公司完成。

1.2.2表面展示載體的構建及其驗證用SacⅠ和ClaⅠ雙酶切信號肽編碼序列和載體pADH1，通過T4連接酶將信號肽編碼序列插入載體pADH1以構建酵母分泌型表達載體pADH1－signal。用F(s)和R(s)引物對重組載體進行PCR驗證，用SacⅠ和ClaⅠ對重組載體進行雙酶切驗證。用EcoRⅠ和SmaⅠ雙酶切載體pADH1－signal和錨定序列，通過T4連接酶將錨定序列插入到分泌型載體pADH1－signal中，構建展示表達載體pADH1－agg。用F(agg)和R(agg)引物對展示表達載體進行PCR驗證，用EcoRⅠ和SmaⅠ對展示表達載體進行雙酶切驗證。相關的酶切，連接和轉化等分子生物學操作采用分子克隆手冊方法，具體參見“Sam-brook＆Russell，2001”。

1.2.3酵母表面展示載體的功能驗證———EGFP展示用XbaⅠ和SmaⅠ雙酶切EGFP和載體pADH1－agg，通過T4連接酶將EGFP編碼序列插入到載體pADH1－agg中，構建展示表達載體pADH1－EGFP。以F(egfp)和R(egfp)為引物進行PCR鑒定，用HindⅢ對pADH1－EGFP和pADH1進行酶切鑒定。分別將含有pADH1－EGFP和pADH1－AGG的酵母在YPDA培養基培養72h(30℃、200r/min)。5000r/min離心5min收集菌體，并用無菌水洗滌菌體2次;用無菌水稀釋菌體并分別熒光顯微鏡的可見和藍光下觀察菌體(10×100倍)。

2結果與分析

2.1相關基因的克隆及序列分析用方法

2.2.1擴增相關的序列，所得到的PCR產物分別經瓊脂糖凝膠電泳分析，結果見圖2。由圖2中可以看出，得到了267bp的信號肽序列、1623bp的凝集素編碼序列和717bp的綠色熒光蛋白編碼序列。DNA序列的測序結果顯示:信號肽編碼序列和GenBank上gi309774076的序列一致，錨定序列與GenBank上gi171041序列一致。EGFP的編碼序列與GenBank上JQ064509.1的序列一致。

2.2表面展示載體的構建

2.2.1酵母分泌型表達載體的構建及驗證用方法

2.2.2構建酵母分泌表達載體并驗證，其結果見圖3。用引物F(s)和R(s)從重組載體中擴增出與預期大小一致的267bp的片段。用SacⅠ和ClaⅠ雙酶切載體pADH1－signal和pADH1的結果顯示:酶切pADH1－signal得到約267bp和7200bp的片段，其中，267bp的片段與信號肽編碼序列大小一致，表明信號肽基因已成功插入到pADH1載體中，pADH1－signal構建成功。

2.2.2酵母展示載體的構建和驗證用方法

1.2.2構建酵母表面展示載體并驗證，結果見圖4。用引物F(agg)和R(agg)從重組載體中擴增出與預期大小一致的1623bp的片段，用EcoRⅠ和SmaⅠ酶切pADH1－agg得到約1645bp和7200bp的酶切片段，其中1645bp的片段大小與錨定序列大小一致，而酶切pADH1－signal后沒有得到1645bp大小的片段，表明錨定序列已成功插入到pADH1－signal載體中，pADH1－agg構建成功。

2.2.3酵母表面展示載體的功能驗證———EGFP展示通過方法

2.2.3將EGFP編碼序列插入pADH1－agg并對重組載體進行PCR和雙酶切驗證。結果見圖5。用引物F(egfp)和R(egfp)從重組載體中擴增出與預期大小一致的717bp的片段。用HindⅢ酶切載體pADH1－egfp可得到大小約2650bp和7200bp的酶切片段，其中2650bp的片段包括267bp的信號肽，1623bp的錨定序列和717bp的EGFP序列，序列總長度與預期一致。而HindⅢ酶切pADH1－agg后不能得到2650bp的片段，表明EGFP序列已插入pADH1－agg中，pADH1－EGFP構建成功。通過方法

2.2.3用熒光顯微鏡觀察菌體細胞，其結果如圖6所示，從圖6可以看出:含pADH1－GFP的酵母菌在可見光下無熒光，但在藍光下有綠色熒光，而陰性對照菌株pADH1－AGG在可見光和藍光下均無熒光。這表明EGFP在酵母中成功地得到了表達。

作者：張秀艷侯曉彥陳福生王小紅單位：華中農業大學食品科技學院