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《中國(guó)生物工程雜志雜志》2014年第七期

1K．marxianus生產(chǎn)酶類

K．marxianus在產(chǎn)酶方面的應(yīng)用是其在現(xiàn)代工業(yè)生物技術(shù)應(yīng)用過程中的最重要的組成部分之一。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，K．marxianus可以分泌產(chǎn)生十余種工業(yè)生物技術(shù)領(lǐng)域的水解酶(表1)。K．marxianus在生產(chǎn)酶類方面具有的優(yōu)勢(shì)，除去本身的耐高溫、生長(zhǎng)快等特點(diǎn)，還可以利用較為廉價(jià)的底物或者誘導(dǎo)物，如乳清和玉米漿［4］等發(fā)酵生產(chǎn)酶類，是工業(yè)生產(chǎn)過程中獲得更為廉價(jià)、更多種類酶類的重要保證。同時(shí)，一些熱穩(wěn)定酶類如脂肪酶、葡萄糖苷酶等均可以從K．marxianus的培養(yǎng)過程中獲得。β-半乳糖苷酶(β-galactosidase)或者乳糖酶可以水解奶制品中的乳糖供許多乳糖不耐癥患者食用，可以解決乳清的處理問題，而且還能生成一種功能性食品 添加劑———低聚半乳糖，促進(jìn)人體內(nèi)雙歧桿菌等益生菌增殖，在食品和醫(yī)藥工業(yè)中具有重要應(yīng)用。目前的商業(yè)用半乳糖酶一般來自于乳酸克魯維等菌株，但其分泌效率太低。K．marxianus是近年來備受關(guān)注的產(chǎn)酶菌株，其產(chǎn)生的半乳糖苷酶是一種誘導(dǎo)酶，在葡萄糖培養(yǎng)基中表達(dá)量不高，在含有乳糖的培養(yǎng)基中能夠得到較高產(chǎn)量的半乳糖苷酶。但也有研究表明一些其他的廉價(jià)底物也可以作為誘導(dǎo)物用于K．marxianus半乳糖苷酶的生產(chǎn)，如玉米漿。以100g/L的玉米漿為底物，K．marxianus所產(chǎn)半乳糖苷酶比用乳糖為培養(yǎng)基時(shí)高20%。此外，溶氧對(duì)半乳糖苷酶的生產(chǎn)至關(guān)重要，當(dāng)攪拌轉(zhuǎn)速/通氣速率為700r/min/0．66vvm時(shí)，半乳糖苷酶的產(chǎn)量比在500r/min/2vvm時(shí)高50%。采用γ-射線對(duì)K．marxianus進(jìn)行誘變后，提高了β-半乳糖苷酶的產(chǎn)量及對(duì)熱的耐受性，敲除轉(zhuǎn)錄抑制因子Mig1的突變株K．marxianusKM實(shí)現(xiàn)了β-半乳糖苷酶的過表達(dá)，達(dá)到121．0U/ml。同時(shí)，由于半乳糖苷酶是胞內(nèi)酶，為了提高其水解乳糖的效果，純酶的使用更能滿足產(chǎn)業(yè)化需求。因此，研究半乳糖苷酶分離純化方法，是滿足其工業(yè)化使用的必要前提。

菊粉酶是一類能夠水解β-2，1果糖糖苷鍵的水解酶，按其作用方式，可分為內(nèi)切型菊粉酶(o-inulinase)和外切型菊粉酶(ex-inulinase)。目前，菊粉酶廣泛應(yīng)用于低聚果糖和高果糖漿生產(chǎn)、以及菊芋乙醇生產(chǎn)等多個(gè)領(lǐng)域。但到目前為止，國(guó)內(nèi)外學(xué)者關(guān)于菊粉酶的研究大多注重產(chǎn)酶菌株的篩選、發(fā)酵條件優(yōu)化及酶基因克隆等方面，涉及菊粉酶分泌表達(dá)調(diào)控的報(bào)道極少。菊粉酶的表達(dá)調(diào)控機(jī)制十分復(fù)雜，而且表現(xiàn)為明顯的菌種依賴特性。目前還沒有完整的調(diào)控體系了解其合成過程，嚴(yán)重阻礙了菊粉酶在工業(yè)化中的應(yīng)用。菊粉酶的分泌除受底物誘導(dǎo)、分解物阻遏外，還與發(fā)酵體系中的溶氧和氮源等因素密切相關(guān)。克魯維酵母菊粉酶的表達(dá)受到分解產(chǎn)物的阻遏，該阻遏是發(fā)生在轉(zhuǎn)錄水平，但對(duì)于其中的調(diào)控機(jī)制仍不清楚。碳源代謝抑制因子CreA和糖代謝激活因子InuR在菊粉酶表達(dá)調(diào)控中具有重要作用。Silva-Santisteban等發(fā)現(xiàn)在葡萄糖、果糖和蔗糖中，菊粉酶分泌的細(xì)胞外動(dòng)力學(xué)相似，但是蔗糖濃度對(duì)菊粉酶活力影響很大，而且富含O2的空氣，既不能提高菊粉酶的產(chǎn)量也不能抑制乙醇的生產(chǎn)。菊粉酶的活性是采用集成生物加工策略(CBP)發(fā)酵菊芋生產(chǎn)乙醇的最關(guān)鍵因素。因此，研究和了解菊粉酶的相關(guān)調(diào)控機(jī)制，對(duì)于菊粉基原料的CBP技術(shù)的發(fā)展至關(guān)重要。我們實(shí)驗(yàn)室研究了K．marxianusYX01菊粉酶的表達(dá)調(diào)控的相關(guān)影響因素，結(jié)果表明菊粉對(duì)菊粉酶的產(chǎn)生具有一定的誘導(dǎo)作用，而葡萄糖對(duì)產(chǎn)酶過程有一定程度的抑制作用;碳源濃度對(duì)K．marxinausYX01產(chǎn)酶具有較為顯著的抑制作用，當(dāng)菊粉濃度為60g/L時(shí)，菊粉酶的活性僅有20g/L時(shí)的50%。通氣量對(duì)菊粉酶分泌有較大影響，當(dāng)通氣量超過0．5vvm時(shí)，菊粉酶活力可達(dá)到不通氣時(shí)的4倍。外加高濃度乙醇對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)有明顯的抑制作用，但并沒有影響菊粉酶分泌，而且對(duì)于分泌到胞外的菊粉酶，其活性基本不受外加乙醇的影響。菊粉酶的產(chǎn)生與乙醇發(fā)酵條件是矛盾的兩個(gè)方面，闡明乙醇發(fā)酵條件下菊粉酶分泌及相關(guān)代謝調(diào)控機(jī)制，是提高菊粉酶活性進(jìn)而提高生產(chǎn)效率的關(guān)鍵。

多聚半乳糖醛酸酶(ploygalacturonase，PG)能夠隨機(jī)地水解兩個(gè)非甲基化的半乳糖醛酸間的α-1，4-糖苷鍵，在水果和蔬菜加工領(lǐng)域具有重要應(yīng)用。PG除在高等植物、霉菌和細(xì)菌中存在，也存在于蝸牛的消化液中。但商業(yè)化應(yīng)用的半乳糖醛酸酶除含PG活性外，還存在不需要的甲酯酶(PE)和淀粉酶。K．marxianus能夠分泌PG而無PE活性，是生產(chǎn)多聚半乳糖醛酸酶的理想菌株。目前影響K．marxianusPG合成因素的研究主要集中在碳源和溶氧兩個(gè)方面。溶氧是PG合成過程中的限制因素，無氧條件有利于PG的積累，而隨著溶氧濃度的增加，PG合成明顯受到抑制，甚至停止分泌。同時(shí)碳源對(duì)于PG的合成也具有不同程度的影響。研究結(jié)果表明，果膠的添加有助于PG的合成分泌，而半乳糖醛酸、多聚半乳糖醛酸或乳糖抑制了PG的合成，甚至使其無法表達(dá)。因此，合適的微氧環(huán)境(同時(shí)滿足單細(xì)胞生長(zhǎng)及PG生產(chǎn)的必須)及碳源誘導(dǎo)物的添加將是K．marxianusPG合成研究的重要方向。脂肪酶廣泛應(yīng)用于有機(jī)化學(xué)合成、醫(yī)藥、食品、皮革、生物轉(zhuǎn)化等多個(gè)領(lǐng)域。K．marxianus分泌的脂肪酶由于具有明顯的熱穩(wěn)定性而受到廣泛關(guān)注。而且以K．marxianus作為宿主異源表達(dá)酯酶(或脂肪酶)為酯酶的研究提供了新的方向。K．marxianus能夠分泌β-葡萄糖苷酶、木糖酶等纖維素水解所需的酶類，在纖維素降解過程中起重要作用。過氧化物歧化酶(SOD)［34-35］、氨肽酶等也均見于K．marxianus分泌產(chǎn)物中，它們也都是因其較高的熱穩(wěn)定性而被人們所關(guān)注。但是對(duì)于這些低產(chǎn)量酶來說，濃縮以及分離純化技術(shù)的研究顯得尤為重要。110綜上所述，K．marxianus所產(chǎn)不同種類的水解酶在生產(chǎn)過程中具有不同的優(yōu)勢(shì)與缺點(diǎn)，但就總體而言仍停留在實(shí)驗(yàn)室階段，并未真正實(shí)現(xiàn)工業(yè)化，主要的問題就是如何盡可能提高其產(chǎn)酶水平來達(dá)到工業(yè)化的要求。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，克魯維酵母與釀酒酵母不同，屬于Crabtree-negative，因此其生長(zhǎng)發(fā)酵的調(diào)控機(jī)制存在差異。最基礎(chǔ)的方式可以采用培養(yǎng)條件的優(yōu)化在一定程度上提高酶活力;進(jìn)一步研究產(chǎn)酶過程對(duì)于氧氣傳遞的響應(yīng)，全面理解氧氣在產(chǎn)酶過程中的重要作用;最后可以采取突變育種或者基因工程改造的方式，獲得較為高產(chǎn)的菌株。另外，對(duì)于酶的分離純化工藝的研究，也將是推進(jìn)其工業(yè)化進(jìn)程的重要方面。

2K．marxianus乙醇發(fā)酵

生物乙醇是目前為止研究最早、技術(shù)最為成熟的生物質(zhì)能源產(chǎn)品，是公認(rèn)的最有可能替代化石能源的生物質(zhì)能源之一。而K．marxianus因其較為廣泛的碳源譜，是現(xiàn)今利用廉價(jià)原料生產(chǎn)乙醇的理想菌株。K．marxianus能夠在較高溫度的條件下發(fā)酵乙醇，為工業(yè)生產(chǎn)過程大大節(jié)約了成本，并減小了污染的可能性。表2給出了K．marxianus利用菊芋、糖蜜、乳清、纖維素等不同底物產(chǎn)乙醇的情況。菊芋(Jerusalemartichoke，JA)以其耐瘠薄、耐鹽堿、抗干旱和生物質(zhì)產(chǎn)量高等優(yōu)點(diǎn)被國(guó)家列為重點(diǎn)發(fā)展的非糧能源植物，其塊莖中的主要成分是菊粉，占干重的60%～70%，由果糖殘基經(jīng)β-2，1糖苷鍵脫水聚合而成，末端為一個(gè)葡萄糖分子，可以通過酸解和酶解等途徑轉(zhuǎn)化為易于發(fā)酵的果糖。以菊芋作為燃料乙醇的底物已進(jìn)行了廣泛的研究，其中利用同時(shí)具有產(chǎn)菊粉酶和乙醇發(fā)酵能力的克魯維酵母進(jìn)行乙醇發(fā)酵(CBP技術(shù))是最有希望實(shí)現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)的技術(shù)路線，但仍然存在發(fā)酵時(shí)間長(zhǎng)、終點(diǎn)乙醇濃度低及剩余殘?zhí)歉叩热秉c(diǎn)。最近，有學(xué)者報(bào)道了綜合利用菊芋秸稈和塊莖，進(jìn)行全生物質(zhì)的發(fā)酵過程，也為菊芋乙醇的工業(yè)化提供了更為全面的保證。我們實(shí)驗(yàn)室對(duì)于利用菊芋生產(chǎn)乙醇進(jìn)行了大量的工作。篩選得到的K．marxianusYX01，以菊粉為底物，發(fā)酵終點(diǎn)乙醇濃度92．2g/L，達(dá)到理論值的85．5%;同時(shí)開發(fā)了批式補(bǔ)料工藝，菊芋干粉生料發(fā)酵的終點(diǎn)乙醇濃度達(dá)到94．2g/L。通過添加輔助酶制劑及換用不同的攪拌槳，進(jìn)一步降低發(fā)酵過程中醪液黏度大的問題，使乙醇的終濃度及收率得到提升，為其工業(yè)化生產(chǎn)奠定了基礎(chǔ)。但是，我們實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)在相對(duì)無氧條件下乙醇得率高于有氧條件，而發(fā)酵時(shí)間卻大大延長(zhǎng)，這嚴(yán)重制約了菊芋乙醇的工業(yè)化進(jìn)程。因此，今后的工作將從提高限氧發(fā)酵過程中菊粉酶活力或調(diào)控發(fā)酵過程的通氣量來達(dá)到在較短發(fā)酵時(shí)間下實(shí)現(xiàn)更高的乙醇得率。K．marxianus可以直接利用乳清中的乳糖生產(chǎn)乙醇。乳清是干酪和干酪素生產(chǎn)過程中的一種副產(chǎn)品，主要成分為乳糖(74%)，其次還有一些蛋白質(zhì)、礦物質(zhì)和脂肪等，是一種理想的生產(chǎn)乙醇的廉價(jià)原料。發(fā)酵乳清生產(chǎn)乙醇還可以解決乳制品生產(chǎn)中廢水排放的問題。但是，一般來說乳清中的乳糖含量較低，使得發(fā)酵終點(diǎn)的乙醇濃度較低，增加了后續(xù)蒸餾成本。但是，通過培養(yǎng)條件的不斷優(yōu)化，利用乳清中的乳糖直接生產(chǎn)乙醇的規(guī)模化生產(chǎn)也將越來越具有競(jìng)爭(zhēng)力。

對(duì)于K．marxianus發(fā)酵糖蜜生產(chǎn)乙醇的報(bào)道也比較廣泛。糖蜜是制糖工業(yè)的一種副產(chǎn)品，也是一種較為理想的廉價(jià)材料。糖蜜種類較多，包括甘蔗糖蜜、甜菜糖蜜、葡萄糖蜜等，不同種類的糖蜜糖含量、糖種類具有差異。以甘蔗糖蜜為例，其還原糖總量可以達(dá)到50%～60%(w/v)，其中蔗糖占60%左右。此外，糖蜜中還含有一些氮源、生物素等促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)的物質(zhì)，但同時(shí)也含有一些對(duì)細(xì)胞有毒害作用的物質(zhì)。在使用糖蜜為碳源時(shí)，由于糖濃度較高，要求細(xì)胞耐滲透壓的能力好，對(duì)乙醇的耐性也要求較高。利用秸稈等纖維素原料生產(chǎn)乙醇一直都是人們關(guān)注的重點(diǎn)，廉價(jià)的原材料可以更大程度地降低燃料乙醇的生產(chǎn)成本，使其在燃料市場(chǎng)上具有更強(qiáng)的競(jìng)爭(zhēng)力。秸稈中主要含有40%左右的纖維素，還含有半纖維素、木質(zhì)素和灰分等組分，水解后得到的葡萄糖、木糖等可以被微生物利用生產(chǎn)乙醇。同步糖化發(fā)酵工藝(SSF)由于能降低分解產(chǎn)物對(duì)纖維素酶的抑制作用，是纖維素乙醇生產(chǎn)最有前途的工藝路線。從目前的研究來看，纖維素酶的最適溫度為50℃左右，與大多數(shù)微生物生長(zhǎng)的最適溫度30℃或者37℃不一致，使得SSF發(fā)酵過程效率很低。K．marxianus具有在高溫條件下生長(zhǎng)并產(chǎn)生乙醇的特性，所以利用K．marxianus實(shí)現(xiàn)纖維素乙醇的同步糖解共發(fā)酵，是未來纖維素乙醇的重要研究方向。來源于Aspergillusniger的內(nèi)切β-1，4葡聚糖酶(o-β-1，4-glucanase，EG)基因和來源于Thermoascusaurantiacus的β-葡糖苷酶(β-glucosidase，BGL)基因、纖維二糖水解酶(cellobiohydrolase，CBH)基因已成功地整合于K．marxianusNBRC1777基因組，在45～50℃條件下，實(shí)現(xiàn)了纖維素酶的功能表達(dá)，為今后更好地實(shí)現(xiàn)同步糖化發(fā)酵纖維素類原料生產(chǎn)乙醇奠定了基礎(chǔ);此外，纖維素降解后含有35%左右的五碳糖，很難被常規(guī)的乙醇發(fā)酵微生物如釀酒酵母所利用。K．marxianus可以利用木糖等生產(chǎn)乙醇，在五碳糖的利用方面具有較為明顯的優(yōu)勢(shì)。但是，K．marxianus利用木糖的速率方面及乙醇的產(chǎn)率還需要進(jìn)一步提高。以K．marxianus為宿主，利用表面展示的方法，將纖維素降解所需的各種酶類如EG、BGL、CBH及木聚糖利用的酶類如木糖苷酶、木糖轉(zhuǎn)運(yùn)酶等表達(dá)，構(gòu)建聯(lián)合加工菌株(CBP菌株)，可能是未來解決纖維素乙醇生產(chǎn)的途徑。

3K．marxianus作為宿主表達(dá)外源蛋白

酵母細(xì)胞用于外源蛋白的分泌表達(dá)一直受到人們的廣泛關(guān)注，S．cerevisiae、P．pastoris等研究相對(duì)成熟的表達(dá)系統(tǒng)以其適于大規(guī)模生產(chǎn)、翻譯后修飾系統(tǒng)較為完善以及無內(nèi)毒素污染等優(yōu)點(diǎn)而被研究人員廣泛應(yīng)用。但同樣酵母細(xì)胞也具有信號(hào)肽加工不完全、誘導(dǎo)周期長(zhǎng)等缺點(diǎn)。近年來，K．marxianus作為宿主細(xì)胞用于表達(dá)外源蛋白方面的應(yīng)用越來越多。三種表達(dá)系統(tǒng)的優(yōu)勢(shì)和不足見表3。正是由于K．marxianus在表達(dá)外源蛋白方面所特有的優(yōu)勢(shì)，對(duì)其進(jìn)一步的研究以及開發(fā)利用顯得更為重要，而且隨著研究和應(yīng)用的深入，K．marxianus作為宿主表達(dá)外源蛋白將能更好地彌補(bǔ)另兩種酵母的不足，取長(zhǎng)補(bǔ)短，更加深化酵母宿主表達(dá)外源蛋白的應(yīng)用。

3．1K．marxianus表達(dá)載體、啟動(dòng)子以及轉(zhuǎn)化方法的研究進(jìn)展表達(dá)載體是基因外源表達(dá)的關(guān)鍵。最早應(yīng)用于K．marxianus轉(zhuǎn)化的表達(dá)載體，pGL2，出現(xiàn)在1984年。但是，真正使得K．marxianus作為表達(dá)宿主而受到人們關(guān)注是由于pKD1質(zhì)粒的發(fā)現(xiàn)，pKD1質(zhì)粒全長(zhǎng)4．8kb，目前以其為基礎(chǔ)而獲得的多種雜交質(zhì)粒已廣泛應(yīng)用于外源蛋白表達(dá)的研究中。啟動(dòng)子的選擇決定了外源基因表達(dá)的成敗。目前應(yīng)用于K．marxianus表達(dá)系統(tǒng)的啟動(dòng)子分為三類:(1)其自身啟動(dòng)子，如PCLP，INU1［68-69］等，而且有實(shí)驗(yàn)表明，比起S．cerevisiae啟動(dòng)子，K．marxianus自身啟動(dòng)子會(huì)明顯提高異源基因在其中的表達(dá)量。Bergkamp等使用INU1成功地實(shí)現(xiàn)了β-半乳糖苷酶的異源表達(dá);(2)來源于S．cerevisiae啟動(dòng)子，如TDH3，GAL1等。目前針對(duì)它們的研究也較為廣泛，許多S．cerevisiae中較為成熟、功能明確的啟動(dòng)子均可直接用于K．marxianus外源基因表達(dá)。Nonklang等以ScTDH3為啟動(dòng)子使得曲霉α-淀粉酶基因得到表達(dá);Lee等測(cè)試了四種在S．cerevisiae較為常見的啟動(dòng)子應(yīng)用于K．marxianus異源表達(dá)的情況，4種啟動(dòng)子表達(dá)強(qiáng)弱為PGPD＞PADH～PTEF＞＞PCYC，為今后異源基因在K．marxianus不同程度的表達(dá)奠定了基礎(chǔ);(3)非酵母啟動(dòng)子，如利用Tet-off［70］啟動(dòng)子構(gòu)建的pTetGus載體成功地實(shí)現(xiàn)了β-葡萄糖醛酸酶基因的異源表達(dá)。適當(dāng)?shù)霓D(zhuǎn)化方法也在整個(gè)重組過程中發(fā)揮重要作用。一套由LiAc介導(dǎo)的K．marxianus細(xì)胞轉(zhuǎn)化方法可以簡(jiǎn)單、快捷地用于K．marxianus的轉(zhuǎn)化過程。而且DMSO對(duì)于轉(zhuǎn)化過程具有抑制作用，而DTT具有促進(jìn)作用，10mmol/L的DTT最適于轉(zhuǎn)化過程的進(jìn)行。多基因同時(shí)整合入K．marxianus染色體技術(shù)［73］的實(shí)現(xiàn)不但大大節(jié)省了人力與時(shí)間，也說明了K．marxianus作為宿主正在研究中逐步趨于成熟。

3．2典型外源蛋白在K．marxianus表達(dá)系統(tǒng)中的分泌表達(dá)K．marxianus作為宿主表達(dá)異源蛋白具有更高的分泌效率，這為后續(xù)的分離純化以及工業(yè)化生產(chǎn)降低成本奠定了基礎(chǔ)。研究表明，K．marxianus所表達(dá)的一種熱穩(wěn)定酯酶，50%左右分泌到了胞外，而相應(yīng)的在K．lactis和S．cerevisiae中只有12%左右，而且在K．marxianus中，只有17%的酶存在于周質(zhì)空間，但在K．lactis中達(dá)到了25%，在S．cerevisiae中，甚至超過了80%。負(fù)責(zé)酵母菌絮凝性狀的絮凝基因成功地在K．marxianus中得到表達(dá)［71］，使其具有絮凝性狀，可能會(huì)提高其對(duì)纖維素預(yù)處理過程中生成的有毒物質(zhì)的耐性及乙醇耐性，為今后其在纖維素乙醇發(fā)酵中的應(yīng)用提供了保證。對(duì)于K．marxianus外源基因的表達(dá)研究在很大程度上受制于其基因工程操作方面理論的不足，很多在S．cerevisiae和K．lactis中比較成熟的轉(zhuǎn)化系統(tǒng)、啟動(dòng)子等都很難用于K．marxianus的表達(dá)過程，而且成功表達(dá)的基因在其蛋白產(chǎn)量、酶活力或者優(yōu)良性狀的獲得方面還有待于進(jìn)一步改善，蛋白或者酶的進(jìn)一步分離提純方法以及產(chǎn)量的進(jìn)一步提高也有待于更多的研究。

4展望

綜上所述，K．marxianus在產(chǎn)酶、乙醇發(fā)酵、外源蛋白分泌等方面都具有較為廣泛的應(yīng)用。K．marxianus所分泌的水解酶用途廣泛，在食品、醫(yī)藥、生物材料、發(fā)酵等諸多領(lǐng)域均有較大的市場(chǎng)需求。而其利用菊芋、乳清、糖蜜、纖維素等生產(chǎn)乙醇也十分符合目前生物能源的發(fā)展趨勢(shì)，為降低成本、增加生物乙醇工業(yè)化可行性打下基礎(chǔ)。K．marxianus在外源蛋白表達(dá)以及基因工程改造上的進(jìn)展拓寬了其在工業(yè)生物技術(shù)方面的應(yīng)用前景，這使K．marxianus在整個(gè)生物技術(shù)領(lǐng)域?qū)崿F(xiàn)了全面的、完整的應(yīng)用體系。但要實(shí)現(xiàn)K．marxianus在工業(yè)生物技術(shù)領(lǐng)域的廣泛應(yīng)用，尚需要更多的理論支持。首先，在產(chǎn)酶方面，K．marxianus分泌的酶類普遍表現(xiàn)出受分解產(chǎn)物的抑制作用，所以各酶類的分泌表達(dá)機(jī)理有待于進(jìn)一步研究，闡明機(jī)理、消除抑制作用最終實(shí)現(xiàn)可控表達(dá);其次，在乙醇發(fā)酵方面，由于其乙醇耐受性較釀酒酵母差，所以，提高K．marxianus的乙醇耐受性將是該菌株能在生物乙醇產(chǎn)業(yè)中應(yīng)用的前提;再次，在外源蛋白表達(dá)和基因工程改造方面，目前對(duì)于K．marxianus外源基因的表達(dá)研究在很大程度上受制于其基因工程操作方面理論的不足，需要構(gòu)建更加完善的表達(dá)系統(tǒng)和啟動(dòng)子。雖然K．marxianus全基因組序列粗框架已公布，但其基因組的注釋及代謝網(wǎng)絡(luò)的確定將為其在基因工程方面的應(yīng)用提供更加有效的理論支持。

作者：高教琪韓錫銅孔亮袁文杰王娜白鳳武單位：大連理工大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院