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《中華腫瘤防治雜志》2015年第二十期

【摘要】

目的RAS相關結構域蛋白1A基因（RASassociateddomainfamily1Agene，RASSF1A）啟動子區超甲基化介導的基因轉錄失活在卵巢癌中頻見，可作為卵巢癌診治過程中有意義的分子生物學指標，RAS相關結構域蛋白2A基因（RASassociateddomainfamily2Agene，RASSF2A）與RASSF1A同源，其基因異常甲基化在多種腫瘤發生發展中發揮重要作用。本研究探討上皮性卵巢癌組織RASSF2A甲基化水平，并分析其臨床意義及高甲基化與mRNA表達情況的相關性。方法選擇2013－10－01－2014－12－31聊城市人民醫院手術治療的50例上皮性卵巢癌、27例交界性上皮性卵巢腫瘤和20例良性上皮性卵巢腫瘤患者，應用甲基化特異性PCR（MSP）檢測卵巢腫瘤組織中RASSF2A基因啟動子甲基化狀態，采用RT－PCR檢測其mRNA表達水平。采用5－氮雜2′－脫氧胞苷（5－aza－dC）對人卵巢癌細胞株SKOV3、3AO進行去甲基化干預實驗，并檢測藥物作用前后RASSF2A基因啟動子甲基化及其mRNA的表達情況。結果RASSF2A基因mRNA在良性上皮性卵巢腫瘤中的表達陽性率為95．00％（19／20），交界性上皮性卵巢腫瘤為59．26％（16／27），上皮性卵巢癌組織為34．00％（17／50），表達強度依次下降，差異有統計學意義，χ2＝21．855，P＜0．001。RASSF2A基因啟動子在良性上皮性卵巢腫瘤組織中的甲基化率為0（0／20），交界性上皮性卵巢腫瘤為22．22％（6／27），上皮性卵巢癌組織為46．00％（23／50），差異有統計學意義，χ2＝15．474，P＜0．001。RASSF2A甲基化水平與卵巢癌患者的年齡、病理類型、臨床分期、組織分化程度及淋巴結轉移無明顯相關性。RASSF2A基因甲基化與其mRNA的表達呈負相關，甲基化陽性組織的mRNA表達水平明顯低于甲基化陰性組織。5－aza－dC藥物作用后，卵巢癌細胞株中RASSF2A基因甲基化被逆轉，而其基因表達明顯升高。結論RASSF2A啟動子區高甲基化導致的基因表達沉默與上皮性卵巢癌的發生發展有關。

【關鍵詞】

上皮性卵巢癌；甲基化；RAS相關結構域蛋白2A基因；基因檢測

上皮性卵巢癌是女性生殖系統中惡性程度最高和預后最差的腫瘤，其病死率居婦科惡性腫瘤首位［1］。大量研究已證實，RAS相關結構域蛋白1A基因（RASassociateddomainfamily1Agene，RASSF1A）啟動子區超甲基化介導的基因轉錄失活是卵巢癌中的頻發事件，可作為卵巢癌診治過程中有意義的分子生物學指標［2－4］。與RASSF1A具有高度同源性的RAS相關結構域蛋白1A基因（RASassociateddomainfamily2Agene，RASSF2A）異常甲基化在多種腫瘤的發生和發展中發揮重要作用。本研究通過RT－PCR和MSP方法檢測良性上皮性卵巢腫瘤、交界性上皮性卵巢腫瘤和上皮性卵巢癌組織及卵巢癌細胞株中RASSF2AmRNA的表達及其啟動子甲基化狀態，分析RASSF2A啟動子甲基化與其mRNA的表達以及卵巢癌臨床病理特征的關系，探討RASSF2A啟動子區甲基化在卵巢癌發生發展中的作用。

1材料與方法

1．1標本來源收集2013－10－01－2014－12－31聊城市人民醫院婦產科收治的上皮性卵巢癌患者50例，交界性上皮性卵巢腫瘤27例，良性上皮性卵巢腫瘤20例。所有組織標本均經病理學確診，所有患者術前均未接受任何放化療或激素治療。標本采集在離體后10min內進行，并迅速放入液氮罐保存，后轉移至－80℃冰箱保存。上皮性卵巢癌病例中，依據2006年FIGO分期標準，Ⅰ～Ⅱ期19例，Ⅲ～Ⅳ期31例；依據2003年WHO組織學分類標準，漿液性腺癌24例，黏液性腺癌16例，子宮內膜樣癌10例；高分化10例，中分化15例，低分化25例；有淋巴轉移27例，無淋巴轉移23例；年齡＜50歲者19例，≥50歲者31例。

1．2細胞株卵巢癌細胞株SKOV3和3AO由聊城市人民醫院中心實驗室提供。

1．3主要試劑Trizol試劑購自美國Invitrogen公司，DNA甲基化試劑盒購自德國Qiagen公司，引物均由上海生工設計合成。

1．4實驗方法

1．4．1細胞培養及藥物處理在37℃、5％CO2及飽和濕度的孵育箱中靜置培養卵巢癌細胞株，用含10％胎牛血清的RPMI1640細胞培養基及時換液。用終濃度為10μmol／L的5－aza－dC處理卵巢癌細胞株，常規換液，保持上述藥物濃度。于藥物連續作用72h后收集細胞。

1．4．2RT－PCR檢測參照Trizol試劑說明書提取組織及細胞總RNA。測得其濃度及純度符合實驗要求后，取2μL總RNA進行逆轉錄。所得cDNA經半定量PCR擴增。RASSF2A基因上游序列為5′－GCG－CCTAGAACGTGTTTTTC－3′，下游序列為5′－ACT－AGGCGTCCTCACATTGC－3′，擴增產物長度為563bp。以GAPDH作為內參基因，上游為5′－CAA－CGGATTTGGTCGTATT－3′，下游為5′－CACAGTC－TTCTGGGTGGC－3′，擴增片段長度為166bp。PCR反應條件為95℃10min，95℃30s，58℃30s，72℃30s，30個循環，最后72℃延伸10min。擴增產物在2％瓊脂糖凝膠電泳，紫外線下觀察實驗結果。

1．4．3DNA的提取及亞硫酸鹽修飾采用酚氯仿法提取組織及細胞總DNA，并對基因組DNA進行亞硫酸鹽修飾，按照甲基化特異性PCR試劑盒說明書進行。所得產物直接用于PCR擴增或保持在－20℃冰箱保存備用。

1．4．4甲基化特異性PCR使用2對引物檢測RASSF2A基因啟動子甲基化狀態。甲基化引物正義鏈為5′－GTTCGTCGTCGTTTTTTAGGCG－3′，反義鏈為5′－AAAAACCAACGACCCCCGCG－3′，非甲基化引物正義鏈為5′－AGTTTGTTGTTGTTTTTTA－GGTGG－3′，反義鏈為5′－AAAAAACCAACAACCC－CCACA－3′，擴增產物長度均為108bp。反應條件為95℃預變性10min，95℃變性30s，58℃復性30s（甲基化）；54℃復性30s（非甲基化），72℃延伸30s，35個循環，最后72℃延伸10min。所得產物電泳后攝像，分析結果。

1．4．5甲基化結果判定標準若僅甲基化引物擴增出陽性條帶，為完全甲基化；若僅非甲基化引物擴增出陽性條帶，為非甲基化；若兩者均擴增出陽性條帶，為部分甲基化。

1．5統計學方法采用SPSS13．0分析數據。RASSF2A甲基化、mRNA表達在卵巢腫瘤組織間的差異以及基因甲基化與臨床病理特征等計數資料采用χ2檢驗或Fishier確切概率法。RASSF2A甲基化及其表達之間的關系采用Spearman相關性分析法。卵巢癌細胞系中RASSF2AmRNA表達量比較采用t檢驗。檢驗水準α＝0．05。

2結果

2．1卵巢腫瘤組織RASSF2AmRNA的表達表1和圖1所示，卵巢良性腫瘤、交界性腫瘤及卵巢癌組織中RASSF2AmRNA表達率依次降低，分別為95．00％（19／20）、59．26％（16／27）和34．00％（17／50），差異有統計學意義，χ2＝21．855，P＜0．001。兩兩比較結果顯示，卵巢癌組與交界性腫瘤組比較，χ2＝4．568，P＝0．033；卵巢癌組與良性腫瘤組比較，χ2＝21．280，P＜0．001；交界性腫瘤組與良性腫瘤組比較，χ2＝7．719，P＝0．005；差異均有統計學意義。

2．2卵巢腫瘤組織RASSF2A基因甲基化水平表1和圖2所示，97例卵巢組織標本均成功進行了MSP實驗。50例卵巢癌組織標本中有13例發生了部分甲基化，10例完全甲基化，甲基化頻率為46．00％（23／50）；27例交界性卵巢腫瘤中甲基化陽性率為22．22％（6／27），其中2例為完全甲基化。而20例良性卵巢腫瘤組織均未擴增出甲基化陽性條帶，甲基化頻率為0，差異有統計學意義，χ2＝15．474，P＜0．001。

2．3RASSF2A基因甲基化與其表達的相關性表2所示，RASSF2A基因甲基化狀態與其mR－NA表達水平呈負相關。在RASSF2A基因發生甲基化的組織中，RASSF2A基因表達明顯降低，提示RASSF2A基因高甲基化可能是該基因表達沉默的原因之一。

2．4甲基化狀態與卵巢癌臨床病理特征相關性表3所示，RASSF2A甲基化程度與卵巢癌患者的年齡、病理類型、臨床分期、分化程度及淋巴結轉移之間無明顯的相關性。

2．55－aza－dC作用結果圖3所示，卵巢癌細胞株SKOV3和3AO中均檢測到RASSF2A基因甲基化，經去甲基化藥物5－aza－dC作用后，SKOV3細胞由完全甲基化轉變為非甲基化，而3AO細胞甲基化狀態被部分逆轉。SKOV3和3AO中RASSF2AmRNA表達水平較低，經藥物干預后，SKOV3（t＝－5．258，P＝0．006）和3AO細胞株（t＝－3．060，P＝0．038）RASSF2AmRNA表達水平明顯升高，差異有統計學意義。

3討論

近年來，隨著腫瘤分子生物學及表觀遺傳學的發展，腫瘤抑制基因失活在癌癥發生發展中的作用越來越受到人們的重視。總的來說，其機制可概括為遺傳學機制及表觀遺傳學機制，換言之，腫瘤抑制基因功能的失活既可以是不可逆的，即遺傳學機制，如基因的突變或染色體的缺失，也可以是可逆的，即表觀遺傳學機制，如基因甲基化或組蛋白修飾。與遺傳學不同，表觀遺傳學主要研究內容不涉及DNA序列的改變，且在細胞分裂過程中具有可遺傳的、可逆性的基因組修飾作用［5］。DNA甲基化是哺乳動物基因組中最普遍的表觀遺傳學事件。相對于Knudson’s的二次打擊學說，基因甲基化僅靠一次打擊就可導致基因失活，腫瘤易感性增加［6］。RASSF2是新近發現的RASSF家族成員之一，生物信息學分析顯示，RASSF2與其他成員一樣，也含有RAS相關域［7］。RASSF2位于人類常染色體20p13，有329個氨基酸的開放閱讀框，11個外顯子。根據不同的啟動子和外顯子選擇剪接，可形成RASSF2A、RASSF2B和RASSF2C3個不同的轉錄本，其中，RASSF2A是最長的轉錄本，也是唯一一個含有5′CpG島的轉錄本。RASSF2A在卵巢癌組織中發揮抑癌基因的作用，如抑制細胞生長，阻滯細胞周期，促進細胞凋亡等，是一個腫瘤抑制基因。本研究分析了RASSF2A基因在上皮性卵巢癌組織中的轉錄表達及其甲基化水平。RT－PC檢測結果顯示，RASSF2A基因表達水平在良性卵巢腫瘤、交界性腫瘤及卵巢癌組織中依次降低，提示RASSF2A的轉錄失活，可能參與了卵巢癌的惡性演進過程，RASSF2A在上皮性卵巢癌中也起到抑癌基因的作用。張嫻等［8］研究結果顯示，RASSF2A基因甲基化可能參與了宮頸癌的發生，與宮頸癌的惡性進展密切相關。本研究結果顯示，良性卵巢腫瘤組織中未發生RASSF2A啟動子區甲基化，而基因異常甲基化從交界性腫瘤到癌呈逐漸上升的趨勢，RASSF2A基因甲基化從無到有，從少到多的現象，說明了RASSF2A基因啟動子區甲基化從卵巢上皮增殖階段就開始起作用，與卵巢癌發生密切相關。多項研究表明，RASSF2A啟動子區高甲基化與基因表達沉默有關［9－11］。本研究結果表明，在發生RASSF2A甲基化的組織中，其基因表達水平明顯下降，兩者呈負相關。結果提示，在卵巢癌中RASSF2A啟動子甲基化是導致其低表達或者表達缺失的重要原因，這在細胞試驗中也得到驗證。應用甲基轉移酶抑制劑5－aza－dC對卵巢癌細胞株進行去甲基化處理后，卵巢癌細胞株的基因啟動子甲基化被逆轉，而其mR－NA的表達水平明顯升高，從而進一步證實了RASSF2A啟動子CpG島的異常甲基化在調節RASSF2A基因的表達中發揮重要作用。研究顯示，RASSF2A基因甲基化程度與宮頸癌、胃癌的淋巴結轉移有關［8，12］，而與胰腺癌和結直腸癌［9，13］患者臨床病理特征無關。另有研究表明，基因啟動子甲基化水平與癌癥患者年齡密切相關［14］。在子宮內膜癌的研究中顯示，＞45歲的患者更容易發生RASSF2A甲基化（P＝0．041）［15］。在結腸癌和口腔鱗癌中也發現，RASSF2A基因甲基化程度與年齡相關［13，16］。在生物個體發育過程中，伴隨著時間的進程，DNA甲基化異常會不斷呈現，由此認為，表觀遺傳學疾病是一種與年齡相關性疾病。這在某種程度上解釋了為什么腫瘤多發生在老年人。檢測DNA甲基化程度可作為細胞衰老的標志之一。本研究結果顯示，RASSF2A基因甲基化水平與卵巢癌患者的臨床病理參數之間無明顯的相關性，是上皮性卵巢癌中的早期頻發事件，隨著患者年齡的增加，RASSF2A基因甲基化有增高的趨勢，但差異無統計學意義，可能上皮性卵巢癌中RASSF2A基因甲基化不是年齡相關的表觀遺傳學改變。

綜上所述，RASSF2A啟動子區的高甲基化是卵巢癌發生和發展過程中的頻發事件，是導致卵巢癌中RASSF2A低表達或表達缺失的重要原因，其參與了卵巢癌的發病過程，并在卵巢癌的發生和發展中發揮著重要作用。監測RASSF2A基因啟動子CpG島甲基化水平可作為表觀遺傳學的分子靶標，指導卵巢癌的診斷及其預后判定。

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作者：武玉 路煒 劉穎 欒鑫 吳秀芳 單位：聊城市人民醫院婦產科 聊城市東昌府人民醫院婦產科