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摘要：目的檢測195例結直腸癌樣本中人乳頭瘤病毒（HPV）的感染情況。方法利用通用PCR法檢測結直腸癌樣本中的HPVDNA，隨后用熒光定量PCR和直接測序法對HPVDNA陽性樣本進行HPV分型，同時統計HPV陽性標本的Kras、PIK3CA和BRAF基因突變情況和臨床病理特征。結果結直腸癌標本中HPV感染陽性率為17.94%（35/195），以HPV16、18型感染為主，且存在混合感染；HPV感染陽性標本中Kras基因突變率為42.85%，PIK3CA、BRAF基因突變率均為2.86%，HPV感染與三個基因突變的相關性均無統計學意義；陽性標本中以右半結腸的癌變居多，癌組織以中分化為主，臨床Ⅱ期多見，多無淋巴結的轉移。結論HPV感染可能與結直腸癌的發生有關，但與Kras、PIK3CA、BRAF基因突變無關。

關鍵詞：人乳頭瘤病毒；結直腸癌；通用PCR；突變

結直腸癌已成為最常見的惡性腫瘤之一，近年來，國內外有研究表明結直腸癌的發生可能與人乳頭瘤病毒（humanpapillomavirus，HPV）的感染有關，但一些研究結果的檢出率低或未檢測到HPV病毒，這可能與人群種族、標本來源、標本數量及檢測方法有關。另有資料顯示Kras、PIK3CA和BRAF基因突變與結直腸癌的發生密切相關。因此本研究利用針對HPVL1區通用引物的PCR法檢測結直腸癌樣本中HPV⁃DNA的存在情況，并用熒光定量PCR和直接測序法對HPV陽性樣本進行分型，同時調查Kras、PIK3CA和BRAF基因突變與結直腸癌HPV感染的相關性。

1材料與方法

1.1樣本來源

收集2014年7月至2016年6月共195例結直腸癌標本，均來自廣州醫科大學附屬腫瘤醫院住院手術病人。其中男性114名，女性81名，中位年齡62歲。

1.2主要試劑和儀器

人乳頭瘤病毒檢測試劑盒和人乳頭瘤病毒核酸分型熒光PCR檢測試劑盒購自潮州凱普生物化學有限公司；DNA提取試劑盒、Kras基因突變檢測試劑盒、PIK3CA基因突變檢測試劑盒和BRAF基因突變檢測試劑盒購自廈門艾德生物醫藥科技有限公司；瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒購自北京天根生化科技有限公司；超微紫外可見分光光度計購自美國Thermofisherscientific公司；PCR擴增儀購自美國ABAppliedBiosystems公司；ABI7500熒光定量PCR儀購自美國Life公司。

1.3方法

1.3.1腫瘤組織DNA提取

組織切片經病理評估合格后，嚴格按照廈門艾德生物醫藥科技有限公司的DNA提取試劑盒說明書進行腫瘤組織DNA提取。所提DNA經微量紫外分光光度計檢測提取質量和濃度，DNA的A260/A280在1.8~2.0之間，DNA-20℃保存。

1.3.2通用PCR法篩查

PCR反應體系共25μl，包括23.25μlPCR混合液、0.75μlDNATaq酶、1μlDNA模板。陽性對照為HPV18克隆質粒，內參為globin基因，陰性對照為ddH2O。反應條件為95℃預熱9min，95℃20s，55℃30s，72℃30s，40個循環，最后72℃延伸5min。

1.3.3熒光定量PCR法HPV分型

熒光定量PCR反應體系共25μl，包括17.50μlPCR混合液、0.50μlDNA聚合酶、2μlDNA樣本。反應條件為：95℃預熱10min，95℃15s，60℃60s，45個循環，最后38℃延伸5s。熒光信號采集點設在60℃60s，儀器運行中進行實時熒光定量檢測，儀器運行結束后直接在熒光定量PCR檢測儀上讀取熒光值。當空白對照Ct值下顯示為Undet，陽性對照Ct值≤36，實驗才視為有效。

1.3.4瓊脂糖凝膠電泳

配制2%瓊脂糖凝膠，取PCR擴增產物5μl與1μlLoddingBuffer混合后，加入凝膠板上的加樣孔。電壓120V/cm，電泳30min。電泳完畢取出凝膠，采用凝膠成像分析系統分析結果。

1.3.5PCR產物序列測定

將初篩陽性結果切膠回收，使用瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒提純出目的DN段，用超微紫外可見分光光度計測量回收的DNA濃度。純化的PCR產物送至潮州凱普生物化學有限公司進行測序。1.3.6Kras、PIK3CA和BRAF基因突變按Kras基因突變檢測試劑盒、PIK3CA基因突變檢測試劑盒和BRAF基因突變檢測試劑盒操作說明進行加樣，三個項目都可用同一個程序，PCR反應參數如下：95℃5min，1個循環：95℃25s，64℃20s，72℃20s，15個循環；93℃25s，60℃35s，72℃20s，31個循環。在第三階段60℃收集信號。

1.4統計學分析

采用SPSS19.0軟件進行統計分析，分析HPV陽性標本與Kras、PIK3CA和BRAF基因突變關系用配對四格表的χ2檢驗，P<0.05為差異有統計學意義。

2結果

2.1通用PCR法篩查HPV⁃DNA檢測結果

通用PCR法篩查195例結直腸癌標本，初篩陽性的標本35例，初篩陽性率為17.94%（35/195）。結直腸癌PCR擴增產物經2%瓊脂糖凝膠電泳后，結果顯示在450bp出現目的條帶。

2.2熒光定量

PCR和直接測序法檢測HPV⁃DNA對HPV初篩陽性的標本進行熒光定量PCR和直接測序，證實均存在HPV感染，以HPV16、18型感染為主，且存在HPV混合感染。2.3HPV感染與Kras、PIK3CA和BRAF基因突變的相關性HPV感染陽性標本中Kras基因突變率為42.86%（15/35），PIK3CA基因突變率為2.86%（1/35），BRAF基因突變率為2.86%（1/35）。在結直腸癌病例中，HPV感染率分別與Kras、PIK3CA和BRAF基因的突變率比較，差異均無統計學意義、（P>0.05），說明HPV感染與三個腫瘤驅動基因的突變可能無關，見表2。2.4HPV感染與結直腸癌病理特征的關系HPV感染陽性標本中以右半結腸的癌變居多（23/35），其次為直腸（10/35）；癌組織以中分化為主（32/35）；臨床分期以Ⅱ期多見（19/35），其次為Ⅳ期（8/35）；病例中多無淋巴結的轉移（25/35）。

3討論

HPV病毒是一種嗜上皮細胞病毒，主要感染皮膚黏膜的上皮細胞，與上皮來源腫瘤的發生、發展有關。HPV病毒DNA由上游調節區（URR）、早期轉錄區（E區）和晚期轉錄區（L區）組成。其中E區包括6個開放閱讀框，依次為E1、E2、E4、E5、E6、E7，與腫瘤的發生有關。L區包括L1、L2，其中HPV⁃DNA的L1區為最為保守的區域。在宮頸癌中，HPV檢出率達到90%以上。近年國內外有研究報道HPV感染與結直腸癌的發生有關，但相關的研究結果差異較大。Li等采用基因芯片方法檢測結直腸腺癌，HPV感染率為48.4%；Bernabe⁃Dones等采用巢式PCR方法在西班牙浸潤性結直腸癌檢出率為42.2%；Burnett⁃Hartman等采用實時熒光定量PCR的方法在西雅圖555例結直腸癌標本中檢出率只有2%；Gazzaz等用雜交捕獲的方法檢測，結果顯示陽性率為0.8%。其原因可能與人群種族、標本來源、標本數量及檢測方法相關，同時病理標本經石蠟的包埋后會造成DNA的降解，造成陽性率降低也是不容忽視的。在Lorenzon等報道中，雖然HPV⁃16在結直腸感染率達到57.1%，但其用含有完整游離HPV16基因的細胞株作比對，對陽性標本中HPV⁃16基因進行相對定量，卻發現非常低的量在組織中，其認為不排除從肛門或臨床處理過程中污染的結果。

認為病毒將其E6、E7基因整合到癌細胞的DNA中，其余基因大多數丟失或者呈游離狀態，以E6、E7以外的基因為目的區域進行檢測將導致低陽性率或出現陰性結果。HPV病毒的檢測方法有原位雜交、基因芯片法以及以PCR為基礎的檢測方法等。其中原位雜交法敏感性較低，方法費時；基因芯片法靈敏度高，但費用較高；PCR法靈敏度及特異性都較高，且其中的實時熒光定量PCR能進行定量和分型的優點。本研究針對L1區保守區域設計通用引物，通過PCR方法篩選出陽性標本再進行熒光定量PCR和直接測序分型。同時調查Kras、PIK3CA和BRAF基因突變情況與結直腸癌HPV感染是否有關。實驗結果顯示陽性率為17.94%，HPV感染的主要型別為HPV16、18型，且存在混合感染，提示結直腸癌與HPV感染有一定的關系，這與Laskar等結果是相一致。陽性標本中Kras基因突變率為42.85%，PIK3CA、BRAF基因突變率均為2.85%，HPV感染與三個基因突變的相關性均無統計學意義。綜上所述，本研究顯示HPV感染可能與結直腸癌的發生有關，但目前沒有研究明確表明HPV參與了結直腸癌的發展，HPV感染如何導致結直腸癌的發生還有待進一步的研究。

參考文獻：

［1］羅妙玲，徐韞健.結直腸癌KRAS、BRAF及PIK3CA基因突變狀態分析［J］.熱帶醫學雜志，2016，16（7）：843-846.

作者：李志陽1；陳舒穎1；張先言2 單位：1.廣州醫科大學附屬腫瘤醫院檢驗科，2.廣東醫科大學醫學檢驗學院