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【摘要】目的:檢測高危型人乳頭瘤病毒(humanpapillomavirus，HPV)在十堰地區(qū)食管鱗癌(esophagealsqua-mouscellcarcinoma，ESCC)組織中的感染率，分析其相關(guān)性。方法:收集十堰地區(qū)87例食管鱗癌組織和50例對照組食管組織，實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測組織中HPV16感染率。結(jié)果:食管鱗癌組織和對照組食管組織中HPV16的檢出率分別為57．5%和36．0%，食管鱗癌組織中HPV16感染率顯著高于對照組(P=0．016＜0．05)。分析食管鱗癌患者年齡、性別、病理分級、大體分型、浸潤深度、淋巴結(jié)侵犯以及TNM分期與HPV16感染的關(guān)系，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。HPV16感染與食管鱗癌患者臨床特征未見顯著相關(guān)性。結(jié)論:HPV16感染可能是十堰地區(qū)食管鱗癌發(fā)生的因素之一，針對高危型HPV感染的防治對于該地區(qū)食管鱗癌的發(fā)生具有重要意義。

【關(guān)鍵詞】食管鱗癌;人乳頭瘤病毒;PCR

食管惡性腫瘤中90%以上的病例為食管鱗癌(esophage-alsquamouscellcarcinoma，ESCC)，是我國常見的消化道腫瘤［1］。由于早期診斷不易明確，疾病進(jìn)展迅速，食管鱗癌患者的5年生存率僅為10%［2］。人乳頭瘤病毒(humanpapillomavirus，HPV)屬于雙鏈環(huán)狀DNA病毒，依據(jù)其與人體惡性腫瘤發(fā)生的關(guān)系，分為低危型和高危型。高危型HPV，包括HPV16與HPV18等，與人體多種腫瘤的發(fā)生均有關(guān)系［3］。Syrjanen［4］在1982年最早依據(jù)鏡下觀察到的食管癌形態(tài)學(xué)的改變提出了高危型HPV感染與食管鱗癌發(fā)生的關(guān)系，近來的研究報(bào)道顯示HPV16與我國食管鱗癌的發(fā)生存在密切關(guān)系。我國的北方太行山區(qū)、新疆地區(qū)均屬于食管鱗癌相對高發(fā)區(qū)，研究表明當(dāng)?shù)厝巳褐惺彻荀[癌患者與HPV16的感染狀態(tài)密切相關(guān)［5，6］。當(dāng)前有關(guān)高危型HPV感染與湖北十堰地區(qū)食管鱗癌發(fā)生的研究尚未見相關(guān)報(bào)道。本研究收集了十堰地區(qū)食管鱗癌新鮮組織標(biāo)本87例和對照組食管良性病變、正常組織等共50例，采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)對組織進(jìn)行HPV分型檢。

1資料與方法

1．1標(biāo)本來源及臨床資料

收集于東風(fēng)總醫(yī)院接受手術(shù)切除并經(jīng)過明確病理診斷為食管鱗癌的新鮮組織標(biāo)本87例，同期收集該院的食管良性病變組織，如食管炎癥、食管瘺、食管憩室等共38例，收集食管正常組織12例。食管良性病變組織和食管正常組織納入為對照組，共50例。所有組織新鮮標(biāo)本均在術(shù)后立即儲(chǔ)存于液氮中備用。所有納入研究的患者之前均未行放療或者化療。食管鱗癌87例患者中，男性58例，女性29例。年齡38～80歲，中位年齡61歲，平均年齡60．09歲。病理分級:高分化9例;中分化66例;低分化12例。依照國際抗癌聯(lián)盟(UICC)制定的TNM國際食管癌分期標(biāo)準(zhǔn)，浸潤深度依次為T1:黏膜下(9例);T2:淺肌層(14例);T3:深肌層(55例);T4:管壁全層(9例)。區(qū)域淋巴結(jié)分期為N0:區(qū)域淋巴結(jié)無轉(zhuǎn)移(51例);N1:區(qū)域淋巴結(jié)有轉(zhuǎn)移(36例)。TNM分期:Ⅰ期11例;Ⅱ期36例;Ⅲ期37例;Ⅳ期3例。病理分型:髓質(zhì)型43例;潰瘍性38例;縮窄性3例;蕈傘型3例。吸煙狀況:吸煙者38例;不吸煙者49例。

1．2組織中DNA的提取

采用購于德國Qiagen公司的人體組織DNA提取試劑盒，按照試劑盒中操作方法和步驟抽提食管鱗癌組織和對照組中的總DNA。

1．3HPV16熒光定量PCR檢測

由上海生工生物有限公司合成HPV16和內(nèi)參照β－ac-tin引物。HPV16上游引物:TCAAAAGCCACTGTGTCCTG，下游引物:CGTGTTCTTGATGATCTGCA，擴(kuò)增長度為120bp。β－actin上游引物:TCACCCACACTGTGCCCATCT，下游引物GTGAGGATCTTCATGAGGTAGTCAGTC，擴(kuò)增長度為106bp。收集各個(gè)樣本DNA，分組并標(biāo)記，加入到PCR反應(yīng)體系中擴(kuò)增。擴(kuò)增條件如下:94℃1min預(yù)變性，95℃5s到60℃30s循環(huán)40次，最后72℃延伸8min。采用購自美國MJResearch公司的MJOpticon2Monitor全自動(dòng)熒光定量PCR檢測儀，設(shè)定PCR反應(yīng)體系為40μl，熒光信號收集設(shè)置為60℃，自動(dòng)對擴(kuò)增進(jìn)行實(shí)時(shí)動(dòng)態(tài)檢測和結(jié)果分析。

1．4統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用SPSS19．0軟件，應(yīng)用χ2檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，P＜0．05被認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果

2．1食管鱗癌組織與對照組中HPV16感染率的比較

共檢測了87例食管鱗癌組織和50例對照組中HPV16的感染率，經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析發(fā)現(xiàn)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=5．856，P=0．016＜0．05)。

2．2食管鱗癌患者臨床病理特征與HPV16感染狀態(tài)的關(guān)系

根據(jù)食管鱗癌患者的中位年齡，將87例患者按照年齡分為≥61歲組和＜61歲組。同時(shí)按照患者的性別、病理分級、大體分型、浸潤深度、淋巴結(jié)侵犯以及TNM分期對食管鱗癌中的HPV16感染狀況進(jìn)行比較分析。結(jié)果如表2所示，HPV16感染率在各個(gè)分組中的差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3討論

食管鱗癌的發(fā)生具有顯著的地域性和種族屬性，與多種因素相關(guān)，包括遺傳、環(huán)境、營養(yǎng)以及病毒感染等［7］。其中高危型HPV，尤其HPV16在食管鱗癌發(fā)生中的作用越來越受到國內(nèi)外研究的重視和報(bào)道。近期有關(guān)HPV16感染與食管鱗癌的研究發(fā)現(xiàn)，食管鱗癌高發(fā)區(qū)患者的食管鱗癌組織中HPV16的檢出率顯著增高，研究者采用原位雜交以及設(shè)計(jì)引物后行PCR檢測，均發(fā)現(xiàn)HPV16感染與食管鱗癌的發(fā)生密切相關(guān)［5，6］。本研究中采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測十堰地區(qū)食管鱗癌組織中HPV16的感染率，結(jié)果顯示食管鱗癌組織中HPV16感染率顯著高于對照組食管組織，這也表明十堰地區(qū)食管鱗癌的發(fā)生與HPV16感染存在顯著相關(guān)性。同時(shí)我們將87例食管鱗癌患者的臨床資料納入研究，分析HPV16感染與食管鱗癌患者臨床病理特征的關(guān)系。統(tǒng)計(jì)分析表明食管鱗癌患者的年齡、性別、病理分級、大體分型、浸潤深度、淋巴結(jié)侵犯以及TNM分期均與HPV16感染無顯著相關(guān)性。這與之前的研究結(jié)果較為一致［8，9］，表明HPV16的感染對于食管鱗癌的臨床病理特征無顯著關(guān)系。

此外，也有研究發(fā)現(xiàn)HPV16感染不僅與食管鱗癌的發(fā)生有顯著關(guān)系，并且HPV16感染的狀態(tài)有可能是影響食管鱗癌患者預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素之一［10］。這也提示我們對于HPV16感染與食管鱗癌患者預(yù)后的影響也是今后的研究方向之一，對于改善食管鱗癌患者的預(yù)后具有積極的意義。然而，一項(xiàng)在閩南地區(qū)的研究發(fā)現(xiàn)，實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)檢測發(fā)現(xiàn)HPV16和HPV18均與該地區(qū)的食管鱗癌的發(fā)生存在相關(guān)性［11］。而一項(xiàng)在河南的研究中也發(fā)現(xiàn)HPV16、HPV18均與食管癌的發(fā)生相關(guān)，并且HPV16與食管鱗癌發(fā)生的關(guān)聯(lián)度高于HPV18［12］。這也表明盡管HPV16感染與食管鱗癌的發(fā)生密切相關(guān)，但同為高危型的HPV18與食管鱗癌的發(fā)生關(guān)系也應(yīng)該受到相應(yīng)的重視，需要進(jìn)一步的后期研究。

綜上，HPV16感染作為生物致癌因素之一，受到廣泛的關(guān)注和研究［13］。本研究中也發(fā)現(xiàn)HPV16與十堰地區(qū)食管鱗癌的發(fā)展有顯著關(guān)系，同時(shí)HPV16的感染與食管鱗癌患者的臨床病理特征未見顯著相關(guān)性。這也提示我們對于食管鱗癌高發(fā)病區(qū)開展高危型HPV流行病學(xué)調(diào)查的必要性，及時(shí)監(jiān)測人群中高危型HPV的感染狀態(tài)。這也有利于及早發(fā)現(xiàn)和干預(yù)食管鱗癌的發(fā)生，對于改善食管鱗癌患者的預(yù)后有積極的臨床意義。

作者：秦豫培；劉鵬；鄒燦；楊麗；孫珊；胡陽黔