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【摘要】目的:探討趨化因子CCL2(ChemokineC-CmotifLigand2)對小鼠黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元的損傷。方法:將CCL2單次注射入C57BL/6J小鼠黑質(zhì)部位，在注射前和注射后的各個時間點(diǎn)分別記錄小鼠的行為軌跡，并將注射后不同時間點(diǎn)的小鼠灌注固定取腦，通過免疫組織化學(xué)方法檢測黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元的數(shù)量變化。結(jié)果:免疫組化檢測顯示在CCL2注射后21d開始黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元的數(shù)量明顯減少，并顯著低于對照組，一直持續(xù)到注射后28d;并且在注射后28d時小鼠的運(yùn)動速度顯著低于對照組。結(jié)論:腦內(nèi)注射CCL2可以損傷小鼠黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元。

【關(guān)鍵詞】趨化因子CCL2;黑質(zhì);多巴胺能神經(jīng)元;小鼠

帕金森病(Parkinson’sdisease，PD)是常見、多發(fā)的與年齡相關(guān)的一種神經(jīng)變性疾病，PD的主要病理表現(xiàn)為黑質(zhì)(substantianigra，SN)多巴胺(dopa-mine，DA)能神經(jīng)元的變性減少［1］。盡管認(rèn)識到DA能神經(jīng)元缺失這一主要神經(jīng)改變是PD發(fā)病的根本已有數(shù)十年之久，但對其確切病因尚沒有滿意答案。近年來人們發(fā)現(xiàn)，腦內(nèi)炎癥在PD的發(fā)病過程中具有重要作用:尸檢分析發(fā)現(xiàn)PD病人黑質(zhì)紋狀體系統(tǒng)中有小膠質(zhì)細(xì)胞的增加和激活，小膠質(zhì)細(xì)胞分泌的促炎因子如TNF-α、IL-1β、IL-6和TGFβ2等明顯增高［2，3］。CCL2(Chemokine(C-CMotif)Lig-and2)又稱MonocyteChemoattractantProtein1(MCP-1)，是CC族趨化因子成員之一，是由炎癥信號誘導(dǎo)分泌的一種典型的趨化因子［4］。在中樞神經(jīng)系統(tǒng)，星形膠質(zhì)細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞都是CCL2的主要來源，在小膠質(zhì)細(xì)胞上有CCL2的特異性受體CCR2［5］。有研究發(fā)現(xiàn)，CCL2可以招募并激活小膠質(zhì)細(xì)胞，表現(xiàn)出吞噬功能并釋放大量的自由基、細(xì)胞毒性細(xì)胞因子等［6］，有文獻(xiàn)報道，PD患者外周單核細(xì)胞CCL2表達(dá)增加，PD病人腦脊液中CCL2的濃度和PD一些癥狀的嚴(yán)重程度呈正相關(guān)［7］。那么CCL2在PD的發(fā)病過程中究竟有什么作用呢，目前為止還未見報道。本文將探討黑質(zhì)內(nèi)注射CCL2是否能夠損傷黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元并引起相應(yīng)的行為學(xué)改變，以期揭示黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元損傷的部分機(jī)制。

材料和方法

1材料

1．1動物

本研究所用動物為8周雄性C57BL/6J小鼠，SPF級，由首都醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗動物部提供。飼養(yǎng)條件為SPF級，動物處于每天12h光照與12h黑暗交替環(huán)境，自由飲水?dāng)z食。

1．2主要試劑

小鼠重組CCL2(Sigma美國)溶于高壓滅菌的0．01mol/LPBS中，終濃度為50ng/μl，所用抗體為小鼠抗TH抗體(Sigma美國)。

2方法

2．1小鼠黑質(zhì)立體定位注射

小鼠稱重，用6%水合氯醛按6ml/kg體重腹腔注射麻醉。將麻醉好的小鼠固定于腦立體定位儀(DavidKopF美國)上，頭部備皮，并用常規(guī)碘酒和酒精消毒，取正中矢狀切口，切開皮膚及皮下組織，鈍性分離，直至暴露顱骨。根據(jù)GeorgePaxinos第二版小鼠腦立體定位圖譜確定黑質(zhì)注射位點(diǎn)坐標(biāo)。選擇的注射位點(diǎn)坐標(biāo)為:前囟后(－)3．00mm，正中線旁開(L)1．1mm，硬腦膜下(V)4．5mm。用牙科鉆于相應(yīng)顱骨處鉆開一小孔，用針頭挑破并去除小孔處的腦膜。用Hamilton微量注射器分別將500ngCCL2(實(shí)驗組)或者相同體積的無菌0．01mol/LPBS(對照組)于上述注射位點(diǎn)按1μl/min的速度緩慢勻速地注射到小鼠黑質(zhì)部位，注射完畢后留針10min，以防止液體溢出，然后緩緩?fù)顺鯤amilton微量注射器。縫合皮膚切口，并用碘酒和酒精消毒，將動物放置于溫暖的環(huán)境中，待其蘇醒后給予食水。取注射后7d、14d、21d和28d4個時間點(diǎn)進(jìn)行檢測，每個時間點(diǎn)取8只動物，總計64只動物。

2．2小鼠行為學(xué)分析

分別于給藥前(0d)和給藥后(7d、14d、21d和28d)記錄小鼠行為軌跡。將小鼠放置于相同的無蓋盒內(nèi)(長30cm，寬20cm)，5min后用SONY數(shù)碼攝影機(jī)從盒子上方記錄小鼠行為運(yùn)動15min，記錄均在上午10點(diǎn)進(jìn)行。采用實(shí)驗動物行為軌跡分析軟件(EthoVision，Version8．0)計算小鼠每5min在盒內(nèi)的平均運(yùn)動速度(cm/s)和運(yùn)動距離(cm)，圖像采集6幀/秒。

2．3灌注取材

不同時間點(diǎn)的小鼠在做過行為學(xué)測試后進(jìn)行灌注固定，用6%水合氯醛腹腔注射麻醉，按6ml/kg劑量給藥，待小鼠進(jìn)入深度麻醉，將小鼠腹面朝上妥善固定于蠟盤上，充分暴露心臟。先灌注0．9%生理鹽水，將血液沖干凈后再灌注含4%的多聚甲醛的磷酸緩沖液(PB)。灌注完畢后，用咬骨鉗剝離顱骨及硬腦膜取出腦，放入上述相同的固定溶液中繼續(xù)后固定4h，然后將腦組織放入含30%蔗糖的PB溶液中脫水，腦組織均4℃保存，待其完全沉底后即可進(jìn)行冰凍冠狀切片，切片厚為40μm，每6張取一張。

2．4免疫組織化學(xué)染色

切片入3%H2O2中10min以清除內(nèi)源性過氧化物酶的活性，切片入0．01mol/LPBS清洗3次，10min/次，切片入封閉液(含5%羊血清和0．01%TritonX-100)封閉1h，以上過程均在室溫下進(jìn)行。切片在一抗(小鼠抗TH抗體，1∶5000)中4℃過夜，再入生物素標(biāo)記的二抗(羊抗小鼠IgG，1∶300)室溫孵育2h，切片入HRP標(biāo)記的鏈酶卵白素(1∶300)室溫孵育2h;以上每個步驟結(jié)束后切片均入0．01mol/LPBS室溫漂洗3次，10min/次。DAB顯色液孵育顯色，控制顯色程度，轉(zhuǎn)入0．01mol/LPBS終止反應(yīng)。切片入0．01mol/LPBS中裱片，自然干燥，酒精脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片;顯微鏡下觀察并拍照。

2．5體式學(xué)計數(shù)

使用Leica普光顯微鏡結(jié)合MBF體視學(xué)計數(shù)系統(tǒng)及其SteroInvestigator(Version8)軟件對SN的DA能神經(jīng)元進(jìn)行計數(shù)。在SN區(qū)所有連續(xù)切片中每6張取1張作為計數(shù)樣本。統(tǒng)計學(xué)處理:應(yīng)用SPSS16．0統(tǒng)計軟件包，所得數(shù)據(jù)均以x珋±s表示。組間比較以t檢驗判斷，P＜0．05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié)果

1小鼠運(yùn)動速度改變?yōu)榱藦男袨閷W(xué)角度觀察CCL2處理是否能對黒質(zhì)造成影響，我們使用檢測動物行為學(xué)改變的經(jīng)典方法曠場實(shí)驗來研究小鼠的運(yùn)動速度是否有改變。實(shí)驗組(CCL2)和對照組(PBS)在注射前0d及注射后7d、14d、21d、28d于相同環(huán)境中檢測，結(jié)果顯示:實(shí)驗組(CCL2)在所有時間點(diǎn)內(nèi)呈整體下降的趨勢，表現(xiàn)出運(yùn)動遲緩、不愛活動，對曠場的探索行為減少。注射后28d時實(shí)驗組(CCL2)小鼠5min內(nèi)平均運(yùn)動速度明顯低于對照組，降低了37．9%(P=0．0087)，其它時間點(diǎn)則無統(tǒng)計學(xué)意義(Fig．1)2CCL2對黒質(zhì)DA能神經(jīng)元有損傷作用注射后7d和14d時實(shí)驗組和對照組相比黒質(zhì)TH陽性神經(jīng)元形態(tài)、數(shù)量差異不明顯;注射后21d時實(shí)驗組與對照組相比可見TH陽性神經(jīng)元數(shù)量與對照組相比減少了25．2%，有顯著性差異(P=0．035)、染色變淺、纖維減少;而注射后28d時，實(shí)驗組TH陽性神經(jīng)元數(shù)量與對照組相比減少的更為明顯，減少了45．4%(P=0．0049，F(xiàn)ig．2)

討論

本研究通過立體定位方法直接注射趨化因子CCL2到小鼠黒質(zhì)，通過多個時間點(diǎn)的檢測，觀察到小鼠在給藥后28d開始行為學(xué)發(fā)生異常改變，包括運(yùn)動速度的減慢，同時免疫組織化學(xué)染色和體視學(xué)計數(shù)方法發(fā)現(xiàn)小鼠黒質(zhì)致密部的DA能神經(jīng)元損傷并減少，說明CCL2本身就可以損傷黒質(zhì)DA能神經(jīng)元。同時，我們的研究也觀察到，DA能神經(jīng)元丟失是逐步的，是隨著CCL2注射時間推移而增加的，當(dāng)丟失到達(dá)一定程度時才對小鼠的行為造成影響，出現(xiàn)PD樣表現(xiàn)，這提示CCL2對神經(jīng)元的損傷具有“進(jìn)行性”的特點(diǎn)，而這些正是PD病程的關(guān)鍵特征，因此CCL2也可用于帕金森病模型的制作。本研究觀察到的這種CCL2對黑質(zhì)DA能神經(jīng)元進(jìn)行性損傷可能與小膠質(zhì)細(xì)胞有關(guān)聯(lián)。近年來帕金森病與神經(jīng)炎癥相關(guān)的觀點(diǎn)日益受到人們的重視［8］，目前已經(jīng)知道，介導(dǎo)腦內(nèi)炎癥的主要是小膠質(zhì)細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞。其中小膠質(zhì)細(xì)胞是中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)的免疫感受與效應(yīng)細(xì)胞，生理情況下，小膠質(zhì)細(xì)胞起著清除代謝產(chǎn)物、維護(hù)組織穩(wěn)定的作用［9］。當(dāng)腦組織受到感染、外傷、缺血或毒性物質(zhì)侵害時，小膠質(zhì)細(xì)胞即被活化，通過釋放多種生物活性物質(zhì)來發(fā)揮多方面的作用，包括促進(jìn)炎癥及抑制炎癥的雙向復(fù)雜作用［10］。CCL2的特異性受體CCR2在中樞神經(jīng)系統(tǒng)主要表達(dá)在膠質(zhì)細(xì)胞上，CCL2通過與之相結(jié)合在小膠質(zhì)細(xì)胞的募集和炎癥擴(kuò)散上起作用［11，12］，CCL2可能募集更多的小膠質(zhì)細(xì)胞到黑質(zhì)從而損傷黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元。以往的研究表明，黑質(zhì)DA能神經(jīng)元表達(dá)CCL2和其受體CCR2［13，14］，黑質(zhì)內(nèi)注射CCL2(50ng)可增加DA能神經(jīng)元的興奮性，導(dǎo)致DA能神經(jīng)元迅速釋放DA［15］，本實(shí)驗所注射的CCL2的計量為500ng，可導(dǎo)致DA能神經(jīng)元更為長久劇烈的興奮性和DA的釋放，也可能是DA能神經(jīng)元損傷并減少的因素之一。

作者：周巖 王丹瀅 孫曉紅 徐群淵 單位：首都醫(yī)科大學(xué)神經(jīng)生物學(xué)系